$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.
1. تحضير مواد التشريح ، وسائط الثقافة ، أجهزة الموائع الدقيقة
- ملقط ومقص التشريح الدقيق للأوتوكلاف (121 درجة مئوية ، وقت التعقيم: 20 دقيقة) وتخزينها في حاوية معقمة.
- قم بتعقيم الأغطية الزجاجية (24 مم × 24 مم) عن طريق احتضانها في 1 M HCl لمدة 24 ساعة على شاكر مداري عند 37 درجة مئوية. اغسلها ثلاث مرات باستخدام H2O معقم ومقطر وثلاث مرات بالإيثانول 99٪. ثم جفف الغطاء عند 37 درجة مئوية أو تحت غطاء تدفق معقم. أخيرا ، قم بالتعقيم أو تعريض الغطاء للأشعة فوق البنفسجية (30 دقيقة) لإكمال التعقيم. يمكن بعد ذلك تخزين أغطية في الإيثانول بنسبة 70٪.
- باستخدام ملقط معقم ، قم بإزالة أجهزة عزل AXIS Axon بعناية من العبوة وضعها في طبق بتري معقم.
- باستخدام لكمة خزعة معقمة (ø: 1 مم) ، قم بإنشاء ثقب واحد لكل عينة ليتم زراعتها (الشكل 1) في مراسلات غرف الاستزراع.
ملاحظه: لا تثقب بالقرب من الأخاديد الصغيرة ، لأنها قد تتلف بسبب الضغط المطبق.
- تعقيم أجهزة عزل AXIS Axon عن طريق غمرها في الإيثانول بنسبة 70٪. ثم جفف أجهزة عزل AXIS Axon والأغطية تماما تحت غطاء تدفق معقم. انتظر 3 ساعات على الأقل قبل المتابعة.
ملاحظه: سيؤدي التجفيف غير المكتمل إلى تجميع معيب لأجهزة الموائع الدقيقة.
- ضع كل غطاء في طبق بتري مقاس 35 مم أو بئر داخل طبق مكون من 6 آبار.
- ضع جهاز عزل AXIS Axon على الغطاء واضغط برفق ولكن بقوة باستخدام ملقط ذو نهايات مثنية للسماح بالالتصاق الكامل بين جهاز العزل والغطاء الزجاجي.
- في كل غرفة استزراع، ماصة 150 ميكرولتر من بولي د-ليسين (0.1 ملغم/مل في H2O معقم ومقطر). ضع أجهزة الموائع الدقيقة تحت فراغ لمدة 5 دقائق ، لإزالة كل الهواء من غرف الزراعة.
- إذا كان لا يزال من الممكن رؤية الهواء داخل الغرف ، فأعد ماصة محلول بولي د-ليسين في الغرف.
- احتضان الأجهزة باستخدام poly-D-lysine O / N عند 37 درجة مئوية.
- اغسل الغرف ثلاث مرات باستخدام H2O المعقم والمقطر.
- املأ الغرف بمحلول عمل لامينين 150 ميكرولتر (Sigma-Aldrich ، 5 ميكروغرام / مل ، في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) أو وسط خال من المصل) ، واحتضان O / N عند 37 درجة مئوية.
- تحضير 50 مل من الوسط لمزارع العقد ثلاثية التوائم بالتركيبة التالية: 48 مل وسط عصبي قاعدي ، 1 مل B-27 ، 100 U / مل بنسلين / ستربتومايسين ، 2 ملي لتر جلوتامين ، 5 نانوغرام / مل عامل نمو الأعصاب (NGF) ، 0.25 جزء من السيتوزين أرابينوسيد.
- تحضير 50 مل من الوسط لمزارع جراثيم الأسنان بالتركيبة التالية: 40 مل من Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) -F12 ، 10 مل مصل بقري للجنين (FBS ، التركيز النهائي: 20٪) ، 100 وحدة / مل بنسلين / ستربتومايسين ، 2 ملي لتر جلوتامين ، 150 ميكروغرام / مل حمض الأسكوربيك.
< p class = "jove_title" >
2. توليد جنين الفأر وتشريحه
- تحديد العمر الجنيني بناء على السدادة المهبلية (السدادة المهبلية: يوم التطور الجنيني 0.5 ، E0.5) وتأكيده عبر المعايير المورفولوجية. بالنسبة لهذا البروتوكول ، نستخدم بشكل عام أجنة الفئران E14.5-E17.5.
- نظف منطقة التشريح والمنظار المجسم بالإيثانول 70٪.
- التضحية بالأم الحامل عن طريق خلع عنق الرحم. ضع رقبة الماوس بين الإصبعين الأول والثاني على شبكة ، واسحب الذيل بشكل حاسم.
- قم بتشريح الجلد حول أسفل البطن وافتح البطن باستخدام المقص. تحديد موقع الرحم: خلال المراحل المتأخرة من الحمل ، يملأ الرحم تجويف البطن بكثرة.
- قم بتشريح الرحم ووضعه في أنبوب مملوء ب PBS على الجليد. عندما تكون على الجليد ، يمكن ترك الأنسجة لعدة ساعات. تخلص من جثة الأم وفقا للإرشادات المؤسسية.
- تشريح الأجنة من الرحم وتحريرها من أنسجتها خارج الجنين. ضع الأجنة في PBS على الجليد.
- اقطع رأس الأجنة باستخدام المقص وافصل الفك السفلي عن باقي الرأس باستخدام مقص التشريح الدقيق (الشكل 2 أ). قم بإزالة الفك السفلي بدقة ، دون الإضرار بالعقد ثلاثية التوائم ؛ نظرا لأن هذا الأخير موضعي على مقربة من الفك السفلي ، فمن الممكن حدوث تلف عرضي. حافظ على الفك السفلي وبقية الرأس في PBS البارد ، على الجليد.
- لتشريح العقد ثلاثية التوائم (TG) ، خذ الرأس وضعه على طبق بتري زجاجي تشريح ، مليء سابقا ب PBS البارد. باستخدام الملقط ، قم بإزالة الجلد والجمجمة. ثم قم بإزالة telencephalon والمخيخ عن طريق وضع ملقط أسفل telencephalon ورفعه. سوف ينقلب الدماغ والمخيخ معا ، تاركين الجزء السفلي من الجمجمة مكشوفا.
- قم بتوطين العقد ثلاثية التوائم (الشكل 2 ب). استخدم الملقط لفصل TG عن الأعصاب ثلاثية التوائم. تخلص من بقايا الإسقاطات ثلاثية التوائم باستخدام إبر التشريح كسكاكين. ضع TG المقطعة في طبق بتري مليء ب PBS البارد واحتفظ بها على الثلج.
- لتشريح الأسنان الجنينية ، ضع الفك السفلي ، الذي تم فصله مسبقا عن الجمجمة ، على طبق بتري الزجاجي المملوء ب PBS البارد. باستخدام إبر التشريح كسكاكين ، قم بإزالة اللسان والجلد المحيط بالفك. افصل بين الفكين الأيسر والأيمن عن طريق القطع على طول خط الوسط للفك. يمكن رؤية جراثيم الأسنان بسهولة ، كما هو موضح في الشكل 2 ج. اعزل جراثيم الأسنان باستخدام إبر التشريح وإزالة الأنسجة الزائدة غير الأسنان. ضع جراثيم الأسنان المقطعة في طبق بتري مليء ب PBS البارد واحتفظ بها على الثلج.
< p class = "jove_title" >
3. الثقافات المشتركة للموائع الدقيقة
- بعد التشريح ، قم بإزالة اللامينين من أجهزة الموائع الدقيقة. املأ الغرف ب 200 ميكرولتر من الوسائط المعنية.
- باستخدام الملقط ، انقل TG التشريح وجراثيم الأسنان برفق إلى الثقوب الناتجة عن التثقيب (الشكل 2 د). تأكد من أن جراثيم الأسنان لا تطفو وأنها تغرق حتى تلامس الغطاء.
- استزراع العينات في حاضنة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
- قم بتغيير وسيط الاستزراع كل 48 ساعة. لا تفرغ الغرف تماما ، ولا تقم بالماصة مباشرة في غرف الاستزراع.
سيؤدي التفريغ الكامل للغرف إلى تكوين فقاعات هواء داخل الغرف ؛ قد يؤدي السحب المباشر إلى الغرفة إلى تلف محوري. لتجنب هذه المشكلات ، قم بإزالة الوسيط الذي يشير إلى الماصة نحو الجانب الخارجي للآبار ؛ وبالمثل ، قم بتقطيع الوسط الطازج على جانب الآبار الموجودة مقابل الغرف .
- يمكن تصوير المزارع المشتركة بسهولة عن طريق الفحص المجهري بفاصل زمني خلال فترة المزرعة ويمكن الحفاظ عليها لأكثر من 10 أيام.
- بعد فترة الاستزراع ، اغسل الغرف عن طريق سحب 150 ميكرولتر من PBS في بئر واحد لكل غرفة ، وترك PBS يتدفق عبر الغرف ثلاث مرات.
- قم بإزالة PBS وإصلاح العينات عن طريق سحب 150 ميكرولتر من بارافورمالدهيد 4٪ (في PBS) في بئر واحد لكل غرفة ؛ احتضان في RT لمدة 15 دقيقة. اغسل الغرف مرتين باستخدام PBS كما هو موضح في 3.6.
- تابع مع مزيد من التحليل.
