$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
ملاحظة: يوضح الشكل 1 أ ، ب مخططا لشريحة البوليمر المشترك الدوري الأوليفين (COC) المجمعة مسبقا ، بما في ذلك مواقع القنوات أو المقصورات الرئيسية والآبار والأخاديد الدقيقة. يمكن للرقاقة المجزأة إنشاء بيئات دقيقة سائلة مميزة داخل المقصورة كما يتضح من عزل صبغة تلوين الطعام (الشكل 1 ج).
فئة
1. طلاء رقائق متعددة المقصورات للخلايا العصبية hSC
ملاحظة: يوضح الشكل 2 أ نظرة عامة على إجراءات الطلاء.
- قم بإذابة بولي إل أورنيثين في الماء المقطر بدرجة زراعة الخلايا لصنع 600 ميكرولتر من المحلول لكل شريحة من محلول عمل 20 ميكروغرام / مل.
- استنشط المحلول الملحي المتبقي بالفوسفات (PBS) المتبقي بعد تحضير الرقائق من الآبار. عند الشفط ، تأكد من أن طرف الماصة بعيدا عن فتحة القناة.
ملاحظه: يجب أن تظل قنوات الموائع الدقيقة ممتلئة طوال هذا الإجراء. لا تستنشق السائل من القنوات / المقصورات ، فقط الآبار.
- قم بتحميل 150 ميكرولتر من محلول عمل بولي إل أورنيثين في البئر العلوي الأيمن. انتظر لمدة 90 ثانية أو حتى يبدأ السائل في ملء البئر السفلي الأيمن. أضف 150 ميكرولتر من الوسائط إلى البئر السفلي الأيمن وانتظر لمدة 5 دقائق للسماح للسائل بالمرور عبر الأخاديد الدقيقة.
- أضف 150 ميكرولتر من الوسائط إلى الجزء العلوي الأيسر جيدا. انتظر 90 ثانية ثم أضف 150 ميكرولتر إلى أسفل اليسار جيدا. لف حامل الشريحة (الشرائق) بالبارافيلم وضعه على حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل.
ملاحظه: بدلا من ذلك ، ضع الشريحة والحامل عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
- قم بشفط الوسائط من الآبار ، مع التأكد من وضع طرف الماصة بعيدا عن فتحة القناة. أضف 150 ميكرولتر من الماء المعقم إلى البئر العلوي الأيمن. انتظر لمدة 90 ثانية ثم أضف 150 ميكرولتر إلى البئر السفلي الأيمن. انتظر لمدة 5 دقائق للسماح للسائل بالمرور عبر الأخاديد الصغيرة.
- أضف 150 ميكرولتر من الماء المعقم إلى البئر العلوي الأيسر ، وانتظر لمدة 90 ثانية ، ثم أضف 150 ميكرولتر أخرى إلى البئر السفلي الأيسر.
- كرر الخطوات 1.5-1.6.
- قم بإذابة اللامينين ببطء عند 2 درجة مئوية إلى 8 درجات مئوية وقم بإعداد محلول عمل 10 ميكروغرام / مل.
- قم بتحميل 150 ميكرولتر من محلول عمل اللامينين إلى البئر العلوي الأيمن. انتظر لمدة 90 ثانية أو حتى يبدأ السائل في ملء البئر السفلي الأيمن. Pipet 150 ميكرولتر إلى أسفل البئر الأيمن. انتظر لمدة 5 دقائق للسماح لللامينين بالمرور عبر الأخاديد الدقيقة.
- أضف 150 ميكرولتر من اللامينين إلى البئر العلوي الأيسر. انتظر 90 ثانية ثم أضف 150 ميكرولتر إلى أسفل اليسار جيدا. احتضان الشريحة داخل حاملها لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية.
- اشطف الرقاقة باستخدام PBS (بدون Ca2+ و Mg2+). قم بتحميل 150 ميكرولتر من PBS إلى البئر العلوي الأيمن. انتظر لمدة 90 ثانية أو حتى يبدأ السائل في ملء البئر السفلي الأيمن. أضف 150 ميكرولتر من PBS إلى البئر السفلي الأيمن وانتظر لمدة 5 دقائق للسماح ل PBS بالمرور عبر الأخاديد الدقيقة.
- Pipet 150 ميكرولتر من PBS إلى أعلى اليسار جيدا. بعد 90 ثانية ماصة 150 ميكرولتر إلى البئر السفلي الأيسر.
- قم بشفط PBS من الرقاقة ثم اشطف الرقاقة بوسائط NSC (انظر جدول المواد). قم بتحميل 150 ميكرولتر من الوسائط في الجزء العلوي الأيمن جيدا. بعد 90 ثانية أو عندما يمر السائل عبر القناة اليمنى إلى البئر السفلي الأيمن ، أضف 150 ميكرولتر إلى البئر السفلي الأيمن. انتظر لمدة 5 دقائق للسماح للوسائط بالتدفق عبر الأخاديد الدقيقة.
- أضف 150 ميكرولتر من الوسائط إلى البئر العلوي الأيسر و 150 ميكرولتر أخرى إلى البئر السفلي الأيسر. احتضان الرقاقة في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2 لتكييف الشريحة مسبقا حتى تصبح جاهزة لبذر NSCs.
ملاحظه: يمكن تكييف الرقائق مسبقا طوال الليل إذا لزم الأمر.
2. بذر NSCs في الشريحة متعددة الأقسام
ملاحظة: استخدم هذا البروتوكول NSCs المشتراة تجاريا ، على عكس منشورنا السابق الذي بدأ بالخلايا الجذعية الجنينية البشرية. في هذا البروتوكول ، يتم طلاء الخلايا الجذعية العصبية مباشرة في الرقائق البلاستيكية حيث تتمايز إلى خلايا عصبية. يمكن السماح للخلايا بالتكاثر كNSCs (بدون تمايز) لما يصل إلى ممرين وتخزينها في قوارير في سائل N2 لمزيد من الاستخدام. يستخدم هذا البروتوكول قوارير NSC المخزنة في السائل N2 بعد المرور 1 أو 2. يوضح الشكل 2 ب نظرة عامة على إجراءات الطلاء.
- قم بإذابة NSCs وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
ملاحظه: ينطبق هذا الإجراء على NSCs المشتقة من H9. ستتطلب خطوط الخلايا الأخرى تحسين كثافة الخلايا.
- احسب تركيز الخلية باستخدام مقياس كثافة الدم واضبطها باستخدام وسائط NSC للحصول على تركيز 7 × 106 خلايا لكل مل.
- استنشق الوسائط من كل بئر من الشريحة. تجنب شفط الوسائط من القنوات الرئيسية.
- Pipet 5 ميكرولتر من محلول الخلية إلى البئر العلوي الأيمن ، متبوعا ب 5 ميكرولتر إلى البئر الأيمن السفلي (إجمالي 70.000 خلية). تأكد من أن الخلايا ماصة باتجاه فتحات القناة الرئيسية. استخدم مجهرا للتحقق من دخول الخلايا إلى القناة. انتظر 5 دقائق حتى تلتصق الخلايا بأسفل الشريحة.
ملاحظه: يمكن استخدام أي من المقصورين أو كليهما لتحميل الخلايا.
- Pipet ~ 150 ميكرولتر من وسائط NSC إلى البئر العلوي الأيمن ثم 150 ميكرولتر إلى البئر الأيمن السفلي. كرر على الجانب الأيسر. احتضان عند 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، 37 درجة مئوية داخل حاوية رطبة مناسبة.
- بعد 48 ساعة ، قم بشفط وسائط NSC من الآبار واستبدلها بوسائط التمايز العصبي بإضافة 150 ميكرولتر إلى كل بئر علوي وكل بئر سفلي.
- زراعة الخلايا العصبية داخل حاضنة 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، 37 درجة مئوية داخل حاوية رطبة مناسبة.
