عزل الخلايا الجذعية من مخيخ الفأر بعد الولادة والتمايز إلى خلايا عصبية

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Edamakanti ، C. R. ، et al. تنقية الخلايا الجذعية Prominin-1 ⁺ من مخيخ الفأر بعد الولادة. J. Vis. Exp. (2020).

يوضح هذا الفيديو طريقة لعزل الخلايا الجذعية من مخيخ الفأر بعد الولادة وتمايزها إلى خلايا عصبية. يتم تنقية الخلايا الجذعية من معلق الخلية المعزولة باستخدام حبات مغناطيسية مغلفة بالأجسام المضادة ويتم زراعتها لتشكيل المجالات العصبية. ثم يتم الحفاظ على المجالات العصبية في وسط تمايز لتوليد الخلايا العصبية.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. إعداد الحلول

1. تحضير محلول تفكك الأنسجة المصنوع من محلول ملحي معقم يحتوي على فوسفات الفينول الأحمر (DPBS) مع غراء (100 وحدة / مل) وسيستين (0.2 مجم / مل) وديوكسي ريبونوكلياز (DNase ، 250 وحدة / مل).
2. لتحضير محلول DNase ، قم بتخفيف 100 مجم من المسحوق المجفف بالتجميد من DNase I (زجاجة واحدة) في 50 مل من H₂O. تخلط جيدا وتصفى محلول المرقة. تحضير 10 مل من مخزون الأسهم. قسم أنبوب مخزون واحد إلى 0.5 مل من الحصص ذات الاستخدام الواحد. قم بتخزين هذه الحصص ذات الاستخدام الواحد عند -80 درجة مئوية.
3. تحضير كواشف الفصل المغناطيسي عن طريق تحضير المخزن المؤقت للعمود المغناطيسي X: 0.5٪ ألبومين مصل البقر (BSA) و 2 ملي مولار محلول حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA).
4. لتحضير وسائط الغلاف العصبي ، استخدم وسيطا عصبيا يحتوي على البنسلين / الستربتومايسين مع L-glutamine ومكملات مع 2٪ B27 ، و 20 نانوغرام / مل عامل نمو البشرة المؤتلف البشري (EGF) ، و 20 نانوغرام / مل عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية المؤتلف البشري (bFGF).
5. لتحضير وسائط التمايز ، استخدم وسيطا عصبيا ومكملا يحتوي على عامل نمو مشتق من الصفائح الدموية 10 نانوغرام / مل (PDGF-AA) أو 10 نانوغرام / مل عامل مثبط لسرطان الدم (LIF) و 2٪ B27.
6. استخدم مرفقا منخفضا للغاية 12 جيدا (3.5 سم²) و 6 آبار (9.6 سم²) ألواح ثقافة.

< p class = "jove_title" >2. تشريح المخيخ

1. تخدير صغار الفئران (P3-P7) بالأيزوفلوران وقطع الرأس باستخدام المقص الجراحي.
2. رش الرؤوس المنفصلة للجراء بنسبة 70٪ من الإيثانول.
3. انقل كل رأس إلى طبق مزرعة فارغ معقم مقاس 10 سم. افصل الجلد باستخدام مقص التشريح المجهري ، ثم قم بإزالة الجمجمة عن طريق تشغيل المقص السهمي على طول خط الوسط.
4. باستخدام ملقط # 7 ، انزع عظام الجمجمة بدءا من جذع الدماغ. ارفع الدماغ بحذر باستخدام ملعقة ، مع الحفاظ على المخيخ سليما ، وانقل الدماغ إلى طبق معقم طازج مقاس 10.0 سم يحتوي على 15 مل من محلول هانكس الملح المتوازن المثلج (HBSS).
5. ضع الطبق الذي يحتوي على الدماغ تحت مجهر التشريح. باستخدام ملقط ناعم # 5 ، قم بإزالة السحايا والأوعية الدموية الكبيرة من المخيخ وافصل المخيخ عن جذع الدماغ باستخدام الملعقة.
6. انقل المخيخ إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل يحتوي على 5.0 مل من محلول HBSS المثلج. اغسل المخيخ عن طريق الشطف والصب 3 مرات باستخدام 5.0 مل من HBSS.
   ملاحظه: يجب وضع كل مخيخ في أنبوبه الخاص لمزيد من المعالجة.

فئة

3. تحضير تعليق الخلية

1. ضع الطبق الذي يحتوي على الدماغ تحت مجهر التشريح. باستخدام ملقط ناعم # 5 ، قم بإزالة السحايا والأوعية الدموية الكبيرة من المخيخ وافصل المخيخ عن جذع الدماغ باستخدام الملعقة.
2. انقل المخيخ إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل يحتوي على 5.0 مل من محلول HBSS المثلج. اغسل المخيخ عن طريق الشطف والصب 3 مرات باستخدام 5.0 مل من HBSS.
   ملاحظه: يجب وضع كل مخيخ في أنبوبه الخاص لمزيد من المعالجة.
3. بعد الشطف الأخير ، أضف 5 مل من محلول تفكك الأنسجة القائم على غراء والذي تم تسخينه مسبقا إلى 37 درجة مئوية. احتضن الأنسجة لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حمام مائي. امزج المحتويات ببطء عن طريق قلب الأنبوب لأعلى ولأسفل 3 مرات إلى 5 مرات كل 3 دقائق إما باستخدام خلاط الجوز أو يدويا.
4. قم بإعداد ماصة باستير ذات قطر عريض (ماصة زجاجية عادية) وماصة باستور ذات قطر ضيق (مصقولة بالحريق عن طريق التسخين فوق موقد بنسن) كما هو موضح سابقا.
5. اغسل المناديل 3 مرات ب 5 مل من محلول HBSS ، وتجنب فقدان الأنسجة أثناء الصب باليد.
6. قم بإزالة آخر غسول HBSS وأضف 5 مل من محلول DPBS الذي يحتوي على 250 ميكرولتر من محلول DNase إلى الأنسجة. قم بفصل الأنسجة عن طريق التخلي من 10x-15x باستخدام ماصة باستور ذات القطر العريض. قم بتنفيذ هذه الخطوة برفق لتجنب تكوين الفقاعات.
7. ثم احتضان الملاط لمدة 10 دقائق إضافية عند 37 درجة مئوية في الحمام المائي ، وخلطه عن طريق قلب الأنبوب وتقويمه.
8. استخدم ماصة باستور ذات القطر المنخفض لزيادة ترتريتريت ملاط الأنسجة 10 أضعاف. إذا بقيت قطع كبيرة من الأنسجة، فاضغط على قطع المناديل على قاع الأنبوب بطرف الماصة برفق واستمر في سحب العينات حتى تصل الخلايا إلى تعليق ناعم.
9. احتضان الأنسجة عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق إضافية ، مع تكرار خطوات الخلط السابقة.

< p class = "jove_title" >4. وضع العلامات المناعية للخلايا الجذعية

1. ضع أنابيب الطرد المركزي على الثلج واستخدم محاليل مثلجة للخطوات التالية. قم بتصفية الخلايا المنفصلة من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل. قم بتغطية الفلتر ب 10.0 مل من محلول HBSS لضمان مرور الخلايا عبر الشبكة في هذا المحلول الإضافي.
2. انقل الخلايا المفلترة إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 15 مل وقم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
3. أعد تعليق الحبيبات في 160 ميكرولتر من المخزن المؤقت للعمود المغناطيسي. للحصول على التعليق أحادي الخلية قبل وضع العلامات المغناطيسية ، قم بتمرير الخلايا عبر شبكة نايلون 30 ميكرومتر لإزالة كتل الخلايا ، والتي يمكن أن تسد العمود.
4. أضف 40 ميكرولتر من الميكروبيدات المضادة للبرومينين -1 إلى كل أنبوب سعة 15 مل ، واخلطه واحتضنه في الثلاجة لمدة 15 دقيقة حتى يرتبط الجسم المضاد بالخلايا التي تعبر عن البرومينين 1.
5. اغسل الخلايا بإضافة 1.0-2.0 مل من العمود العازل X وجهاز الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق.
6. أعد تعليق الحبيبات في 1.0 مل من المخزن المؤقت للعمود X.
   ملاحظه: إذا شوهدت كتل صغيرة بعد إعادة تعليق الحبيبات بسعة 1.0 مل من المخزن المؤقت للعمود X ، فيجب إزالتها بعناية باستخدام طرف ماصة باستور ، وإلا يمكن لهذه الكتل أن تسد العمود المغناطيسي أثناء فرز الخلايا.

فئة

5. تحضير العمود المغناطيسي وفرز الخلايا والطلاء

ملاحظة: يجب إجراء الفصل المغناطيسي عن ظروف النمط الجيني المختلفة (المرض مقابل السيطرة) في نفس الوقت ، لأن أي تأخير قد يؤثر على مورفولوجيا الغلاف العصبي.

1. قم بإعداد الأعمدة المغناطيسية عن طريق وضعها على الحامل المغناطيسي المعرض للمجال المغناطيسي. اشطف العمود مرة واحدة ب 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت X عن طريق تطبيق المخزن المؤقت الذي يقطر في أنبوب الطرد المركزي ليتم التخلص منه.
   ملاحظه: إعداد عازلة العمود المغناطيسي الجديد X لكل تجربة ؛ إذا لم يكن الأمر كذلك ، فسيكون إنتاج الخلايا الجذعية منخفضا.
2. قم بتطبيق تعليق الخلية المسمى على العمود. اجمع التدفق الذي يحتوي على خلايا غير مصنفة تتكون بشكل أساسي من خلايا مختلطة من الخلايا العصبية المخيخية / الدبقية في أنابيب جديدة سعة 15 مل (الشكل 1 أ).
3. اغسل العمود 3x ب 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت X (تستغرق كل غسلة حوالي 2-4 دقائق).
   ملاحظه: يمكن أن تكون الثقافة المختلطة العصبية المخيخية / الدبقية المخصبة بالخلايا العصبية الحبيبية المخيخية بمثابة منتج ثانوي مفيد لخطوة التنقية هذه.
4. قم بإزالة العمود من المجال المغناطيسي وضعه في أنبوب سعة 1.5 مل. أضف 1.0 مل من وسط الثقافة (وسط الغلاف العصبي) إلى العمود وادفع المكبس إلى العمود لطرد الخلايا الموسومة بخرز برومينين -1 في أنبوب صقر جديد سعة 1.5 مل.
5. لتعزيز نقاء الخلايا المسماة بالبرومينين -1 ، مرر الخلايا الملطخة فوق عمود ثان باتباع الخطوات 5.1-5.4.
6. عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم. العائد النموذجي هو 10⁷ خلايا لكل مخيخ. ضع الخلايا على ألواح تثبيت منخفضة للغاية (6 أو 12 بئرا ، بناء على الكثافة المطلوبة للتجارب النهائية).

< ص الفئة = "jove_title" >6. مرور المجالات العصبية والتمايز

1. ضع الخلايا الجذعية المسماة برومينين 1 على 12 لوحة بئر منخفضة للغاية في وسط الغلاف العصبي (5,000 خلية / بئر).
2. بعد 7-10 أيام ، تنقسم الخلايا لتنتج مجالات عصبية عائمة على شكل كرة (المجالات العصبية الأولية).
   ملاحظه: في هذه التجربة ، يتم إنشاء المجالات العصبية الثانوية التي تتوسع في الأعداد لمزيد من الاستخدام. لا يتم استخدام مجموعات الغلاف العصبي الأولية في هذه التجارب لأنها قد تحتوي على خلايا ملوثة ليس لها خصائص الخلايا الجذعية ويمكن أن تتكتل مع المجالات العصبية.
3. للمرور، انقل المجالات العصبية الأولية جنبا إلى جنب مع وسائط المزرعة باستخدام أطراف ماصة سعة 1.0 مل إلى أنبوب طرد مركزي معقم سعة 15 مل. حبيبات المجالات العصبية عن طريق الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق وتخلص من المادة الطافية.
4. أعد تعليق الحبيبات في 5 مل من وسائط تفكك الأنسجة التي تحتوي على غراء أو محلول تربسين 0.05٪. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
5. قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
6. ضع الخلايا (مرة أخرى) في وسط الغلاف العصبي كما هو موضح سابقا. بعد 7-10 أيام في الثقافة ، يجب إثراء اللوحة بالمجالات العصبية الثانوية.
   ملاحظه: يمكن تمرير هذه الثقافات حتى 8 أضعاف بكفاءة جيدة ، وبعد ذلك يميل حجم الغلاف العصبي إلى أن يكون أصغر ويشير إلى انخفاض الانتشار.
7. عد الخلايا على مقياس الدم ولوحة العدد الأمثل للتجارب المستقبلية على الألواح المطلية ب poly-D-lysine (6 أو 12 بئرا).
8. للتمييز بين الخلايا الجذعية ، اجمع المجالات العصبية من الممر الثاني إلى الثامن عن طريق الطرد المركزي كما هو موضح سابقا ، باستثناء إضافة وسيط تمايز إلى الحبيبات.
   ملاحظه: بعد 7 أيام في المختبر ، تتمايز الخلايا الجذعية إلى خلايا عصبية وخلايا نجمية وخلايا قليلة التغصن ، كما يتضح من تلطيخ العلامة العصبية β-III tubulin ، وعلامة الخلايا النجمية البروتين الحمضي الليفي الدبقي الدبقي (GFAP) ، وعلامة قليلة التغصن O4.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: عزل الخلايا الجذعية البرومينين -1 من المخيخ بعد الولادة. (أ) تم عزل الخلايا الجذعية المخيخية باستخدام حبات البرومينين -1 المغناطيسية المناعية. اللوحة العلوية: شكلت الخلايا الجذعية المنقاة (المرتبطة بالعمود) مجالات عصبية ذات خصائص تكاثر وتجديد ذاتي واسعة النطاق. لم تكن الخلايا غير المرتبطة بالعمود (التدفق) قادرة على تكوين المجالات العصبية. بدلا من ذلك ، أصبحوا خلاي...

المواد