تثقافف الخلايا العصبية العقدية الشبكية مع التغليف الشمي الشمي

الملخص

المصدر: Portela-Lomba, M., et al. الزراعة المشتركة للخلايا العصبية العقدية الشبكية للفئران ذات التغليف الشمي Glia ، كنموذج في المختبر لتجديد العصبية العصبية للبالغين. J. Vis. Exp. (2020)

يوضح هذا الفيديو إجراء عزل الخلايا العصبية العقدية الشبكية (RGNs) من شبكية العين وزراعتها مع الخلايا الدبقية الشمية (OEG). تسمح هذه الطريقة بدراسة إمكانات التجدد العصبي ل OEGs بعد الإصابة العصبية.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. إعداد ihOEG (Ts12 و Ts14) للفحص

ملاحظة: يجب أن تتم هذه الخطوة قبل 24 ساعة من تشريح RGN والزراعة المشتركة.

1. عالج أغطية 12 مم Ø مع 10 ميكروغرام / مل بولي إل ليسين (PLL) لمدة 1 ساعة < / > ملاحظه: يمكن ترك الغطاء طوال الليل في محلول PLL.
2. اغسل الغطاء بمحلول ملحي عازل للفوسفات 1x (PBS) ثلاث مرات.
3. افصل خلايا Ts12 و Ts14 ihOEG من طبق زراعة الخلايا p60.
   1. أضف 4 مل من وسط ثقافة DMEM/F12 (الوسط القاعدي)-FBS (مصل الأبقار الجنينية) إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. يسخن عند 37 درجة مئوية في حمام مائي نظيف.
   2. قم بإزالة الوسط من الألواح واغسل الخلايا ب 1 مل من 1x PBS (محلول ملحي مخزن بالفوسفات) -EDTA (حمض رباعي الإيثيلين ديامين) مرة واحدة.
   3. أضف 1 مل من التربسين EDTA إلى خلايا OEG واحتضن لمدة 3-5 دقائق عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
   4. اجمع الخلايا باستخدام ماصة p1000 وانقلها إلى الوسط المعد في الخطوة 2.1.
   5. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 200 × جم.
   6. تطمح إلى طاف.
   7. أضف 1 مل من وسط ME10 وأعد تعليق الحبيبات.
   8. احسب رقم الخلية في مقياس كثافة الدم.
4. قم بزرع 80,000 Ts14 خلية أو 100,000 خلية Ts12 / بئر على الغطاء في ألواح 24 بئرا في 500 ميكرولتر من وسط ME10.
5. خلايا المزروعة عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 24 ساعة.

< p class = "jove_title" >2. تشريح أنسجة الشبكية

ملاحظة: يتم استخدام ذكور فئران Wistar البالغة من العمر شهرين كمصدر RGN. شبكية العين (فأر واحد) ل 20 بئرا من طبق خلوي مكون من 24 بئرا. الأوتوكلاف المواد الجراحية قبل الاستخدام. يتم شراء مجموعة تفكك غراء تجاريا (جدول المواد). اتبع تعليمات مقدم الخدمة لإعادة التشكيل. أعد تكوين حمض D و L-2-amino-5-phosphonovaleric (APV) في مخزون 5 ملي مولار وإعداد الحصص العليا.

1. في يوم الفحص ، قم بإعداد الوسائط التالية.
   1. قم بإعداد طبق ثقافة خلية p60 مع 5 مل من EBSS البارد (محلول ملح إيرل المتوازن) (قارورة 1 من مجموعة تفكك غراء).
   2. قم بإعداد طبق زراعة الخلايا p60 مع قارورة معاد تكوينها 2 (غراء) من مجموعة تفكك غراء بالإضافة إلى 50 ميكرولتر من APV. ثم أضف 250 ميكرولتر من القارورة المعاد تكوينها 3 (DNase بالإضافة إلى 5 ميكرولتر من APV).
   3. في أنبوب معقم ، امزج 2.7 مل من القارورة 1 مع 300 ميكرولتر من القارورة 4 (مثبط البروتياز الألبومين والبيض). أضف 150 ميكرولتر من القارورة 3 (DNase) بالإضافة إلى 30 ميكرولتر من APV.
   4. تحضير 20 مل من وسط Neurobasal-B27 (NB-B27).
2. التضحية بفأر بالاختناق بثاني أكسيد الكربون₂.
3. قم بإزالة الرأس عن طريق قطع الرأس بالمقصلة ؛ ضعه في طبق بتري 100 مم ورش الرأس بالإيثانول بنسبة 70٪ قبل وضعه في غطاء تدفق رقائقي.
4. قطع شعيرات الفئران بالمقص حتى لا تتداخل مع التلاعب بالعين.
5. أمسك العصب البصري بالملقط لسحب مقلة العين بما يكفي لتتمكن من عمل شق عبر العين بمشرط.
6. قم بإزالة العدسة والخلط الزجاجي واسحب شبكية العين (الأنسجة الشبيهة بالبرتقال) بينما تبقى الطبقات المتبقية من العين (بما في ذلك الطبقة الظهارية الصباغية) بالداخل.
7. ضع شبكية العين في طبق زراعة الخلايا p60 المحضر في الخطوة 2.1.1.
8. انقل شبكية العين إلى طبق زراعة الخلايا p60 المحضر في الخطوة 2.1.2 وقم بتقطيعه بالمشرط إلى قطع صغيرة بحجم تقريبي < 1 مم.
9. انقله إلى أنبوب بلاستيكي سعة 15 مل.
10. احتضان الأنسجة لمدة 30 دقيقة ، في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ ، مع التحريك كل 10 دقائق.
11. قم بفصل كتل الخلايا عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة باستور زجاجية.
12. جهاز الطرد المركزي لتعليق الخلية عند 200 × جم لمدة 5 دقائق.
13. تخلص من المادة الطافية. لتعطيل غراء ، أعد تعليق حبيبات الخلية في المحلول المحضر في الخطوة 2.1.3 (1.5 مل للعينين).
14. قم بسحب تعليق الخلية هذا بعناية إلى 5 مل من القارورة المعاد تكوينها 4.
15. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق.
16. أثناء الطرد المركزي ، قم بإزالة وسيط ME-10 تماما من لوحة خلية البئر OEG 24 (المعدة مسبقا في الخطوة 1) واستبدله ب 500 ميكرولتر من وسط NB-B27 لكل بئر.
17. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 2 مل من وسط NB-B27.
18. لوحة 100 ميكرولتر من تعليق خلية الشبكية ، لكل بئر من لوحة m24 ، على طبقات أحادية الطبقات المعالجة ب PLL أو OEG.
19. حافظ على المزارع عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 96 ساعة في وسط NB-B27.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مكمل B-27 جيبكو 17504044 د ، L-2-أمينو-5-حمض فوسفونوفاليريك سيغما 283967 مثبط مستقبلات NMDA DMEM-F12 جيبكو 11320033 وسط زراعة الخلية FBS جيبكو 11573397 مصل الأبقار الجنينية FBS-Hyclone فيشر ساينتيك 16291082 مصل الأبقار الجنينية ل-جلوتامين لونزا BE17-605F الوسط العصبي القاعدي جيبكو 21103049 وسط زراعة الخلايا العصبية نظام تفكك غراء شركة ورثينجتون للكيمياء الحيوية LK003150 للاستخدام في عزل الخلايا العصبية برنامج تلفزيوني صنع منزلي برنامج تلفزيوني - EDTA لونزا H3BE02-017F البنسلين / الستربتومايسين / الأمفوتريسين ب لونزا 17-745 [إ] الجراثيم ومبيد للجراثيم مستخلص الغدة النخامية جيبكو 13028014 مستخلص الغدة النخامية البقرية بولي -L- ليسين (PLL) سيغما أ -003 م