تقنية لعزل الخلايا الساتلية من أنسجة عضلة رأس الفئران

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Carvajal Monroy ، P. L. ، وآخرون. عزل وتوصيف الخلايا الساتلية من عضلات رأس الفئران المتفرعة. J. Vis. Exp. (2015).

يوضح هذا الفيديو عزل الخلايا الساتلية عن أنسجة العضلات المتفرعة لرأس الفئران من خلال تشريح الأنسجة ، والهضم الأنزيمي ، والتنقية الميكانيكية والطرد المركزي اللاحقة. ثم يتم زرع الخلايا في آبار مغلفة بالمصفوفة خارج الخلية للتمايز إلى الخلايا العضلية ، وفي النهاية إلى الأنابيب العضلية وألياف العضلات الناضجة.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

< p class = "jove_title" >1. بقع جل المصفوفة خارج الخلية

1. قم بتنفيذ الخطوات التالية قبل يوم واحد من الحجر الصحي:
   1. قم بإذابة كمية من هلام المصفوفة خارج الخلية (100 ميكرولتر) عند 4 درجات مئوية لمدة 1.5 ساعة على الأقل. خفف 1:10 في وسط النسر المعدل من Dulbecco ؛ مع 4,500 مجم / لتر جلوكوز ، و 4 ملي مولار لجلوتامين ، و 110 مجم / مل بيروفات الصوديوم (DMEM). احتفظ بجل المصفوفة خارج الخلية عند 4 درجات مئوية في جميع الأوقات.
      ملاحظة: ستؤدي التغيرات المفاجئة في درجات الحرارة إلى طلاء غير متساو وتكوين بلوري.
   2. احتفظ بمحلول هلام المصفوفة خارج الخلية المخفف على الثلج لمدة 15 دقيقة.
   قم
   3. بتبريد ماصة دقيقة سعة 20 ميكرولتر مسبقا لمدة 10 دقائق.
   4. ضع شرائح حجرة مكونة من 8 آبار في طبق بتري مقاس 100 مم وانقل الطبق إلى سطح بارد (مثل عبوة الفريزر) لمدة 10 دقائق.
   5. استخدم الماصة الدقيقة المبردة مسبقا لوضع قطرة من 10 ميكرولتر من هلام المصفوفة خارج الخلية في كل بئر. احتفظ بطبق بتري على السطح البارد لمدة 7 دقائق أخرى على الأقل (الشكل 1 أ).
   6. قم بإزالة جل المصفوفة خارج الخلية المتبقي تماما (الشكل 1 ب) وجفف الآبار عند 37 درجة مئوية طوال الليل.

< ص الفئة = "jove_title" >2. تشريح عضلات الرأس (الماستر ، والدسينج ، والرافعة Veli Palatini)

1. قبل التشريح ، قم بإعداد 50 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) مكمل بنسبة 2٪ بنسلين ستربتومايسين (P / S). ابق على الجليد.
2. بعد القتل الرحيم لفأر شاب بالغ (9 أسابيع) مع ثاني أكسيد الكربون₂ / O₂ ، اقطع رأس الرأس وأزل الجلد من الرأس. انقل الرأس إلى PBS المثلج المكمل ب 2٪ P / S في أنبوب سعة 50 مل.
3. عضلة المضطرب (مشتقة من القوس الفرعي الأول)
   1. ضع الرأس مع جانب واحد لأعلى على وسادة سيليكون وثبته بإبر تحت الجلد (الشكل 2 أ).
   2. حدد الغدة النكفية والعصب الوجهي (الشكل 2 أ). كشف اللفافة العميقة التي تغطي الغدة. قطع اللفافة وإزالة الغدة باستخدام مقص التشريح. تحديد القناة السمعية الخارجية. تتبع العصب الوجهي من الثقبة البرية المستقرة وقم بإزالة الفروع الصدغية والوجنجية والشدقية بعناية بشفرة مشرط رقم 15.
   3. تحرير الرأس السطحي لعضلة المضغ عن طريق إزالة اللفافة. تحديد كل من الرؤوس السطحية والعميقة لعضلة المضغة. تتبع الرأس السطحي حتى يتم إدخال الشلل السميك في الوتر السميك في العملية الوجانية للفك العلوي.
   4. افصل الوتر عن أصله في العملية الوجانية باستخدام ملقط مستقيم. قم بقصها بشفرة مشرط رقم 15 أو مقص تشريح وارفعها بعناية (الشكل 2 ب).
   5. قم بتشريح الرأس السطحي للمضغ حتى يتم إدخاله في الزاوية والنصف السفلي من السطح الجانبي لراموس الفك السفلي بشفرة مشرط رقم 15 (الشكل 2 ج). الآن ، قم بإزالة العضلات تماما.
4. البطن الخلفي للعضلة ثنائية المعدة (مشتقة من القوس الفرعي 2)
   1. ضع الرأس في وضع ضعيف على وسادة السيليكون وثبته بإبر تحت الجلد (الشكل 3 أ).
   2. إزالة الدهون تحت الجلد التي تغطي كل من الغدد تحت اللسان وتحت الفك السفلي. بعد ذلك ، قم بإزالة اللفافة والغدد السطحية باستخدام مقص التشريح. كشف العضلة المشنقية (البطن الأمامي والخلفي).
   3. أمسك الوتر الأمامي للبطن الخلفي بملقط مستقيم ، واقطعه ، وقم بتشريحه بعناية حتى يصبح أصله في الفقاعة الطبلية (الشكل 3 ب). افعل الشيء نفسه على الجانب المقابل.
5. عضلة الرافعة فيلي الحنكية (مشتقة من القوس الفرعي 4)
   1. بعد تشريح البطن الخلفي للعضلة الدخمس ، قم بتوطين العضلة البربرية ، واسحبها بشكل جانبي ، وقم بإزالتها بعناية (الشكل 4 أ).
   قم
   2. بتوطين وتر الرافعة veli palatini الذي يتم إدخاله في الفقاعات الطبلية (الشكل 4 أ). قم بتشريحها بعناية وقطعها على كلا الجانبين.
   3. ابحث عن القصبة الهوائية والمريء الذي يمتد خلفها. ارفع المريء وكشف البلعوم والحنجرة.
   4. توطين وتشريح منطقة عضلة انقباض البلعوم العلوي. حدد الرافعة veli palatini واقطعها على كلا الجانبين (الشكل 4 ب).
      ملاحظه: مباشرة بعد التشريح ، قم بإزالة الأوتار والنسيج الضام بعناية من كل عضلة تحت المجهر الاستريو. اغمر جميع العينات بسرعة في 70٪ من الإيثانول وانقلها إلى PBS المثلج المكمل بنسبة 2٪ P / S في أنبوب سعة 15 مل.

3. عزل الخلايا الساتلية (SCs)

1. قم بتنفيذ خطوات التحضير التالية لعزل SC عن مجموعات العضلات الثلاث:
   1. تحضير 7.5 مل من 0.1٪ بروناز في DMEM. قم بتصفية المحلول من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر. قم بتسخين المحلول مسبقا عند 37 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 10 دقائق قبل العزل.
   2. تحضير 35 مل من DMEM مع 10٪ مصل الخيول (HS) و 1٪ P / S. أيضا ، قم بالتسخين المسبق عند 37 درجة مئوية في حمام مائي.
   3. تحضير وسط استزراع 15 مل يتكون من DMEM مكمل بنسبة 20٪ مصل بقري للجنين (FBS) و 10٪ HS و 1٪ P / S و 1٪ مستخلص جنين الدجاج (CEE). قم بالتسخين المسبق عند 37 درجة مئوية في حمام مائي.
   4. قم بتغطية ست ماصات بلاستيكية (10 مل) مسبقا بنظام HS وجففها لمدة 10 دقائق على الأقل قبل الاستخدام.
2. في غطاء المزرعة ، انقل كل عضلة إلى بئر من صفيحة 6 آبار. باستخدام مقص التشريح ، قم بقطع العضلات إلى قطع صغيرة حوالي 2 مم. احرص على عدم فرم الأنسجة كثيرا.
3. أضف بعناية 2.5 مل من محلول بروناز 0.1٪ إلى كل بئر واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. رج الطبق برفق بعد 20 و 40 و 60 دقيقة < / > ملاحظه: تعتمد المدة الدقيقة للحضانة على عوامل مثل عمر وسلالها.
4. مراقبة تحت المجهر. افحص شظايا العضلات وأوقف الهضم الأنزيمي عندما تظهر حزم الألياف مرتخة (الشكل 5).
5. أضف 2.5 مل من DMEM مع 10٪ HS و 1٪ P / S. انقله إلى أنبوب سعة 15 مل وقم بالطرد المركزي للأنابيب عند 400 × جم لمدة 5 دقائق.
6. أضف 5 مل من DMEM مع 10٪ HS و 1٪ P / S. ماصة المحلول لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة بلاستيكية سعة 10 مل (trituration) 20 مرة على الأقل لتجانس الأنسجة.
قم
7. بالطرد المركزي للأنابيب عند 200 × جم لمدة 4 دقائق.
8. أضف 5 مل من DMEM مع 10٪ HS و 1٪ P / S. الماصة مرة أخرى بماصة بلاستيكية سعة 10 مل حتى تمر شظايا الأنسجة بسهولة.
قم
9. بالطرد المركزي للأنابيب عند 200 × جم لمدة 4 دقائق واجمع المادة الطافية في أنبوب سعة 15 مل.
10. ضع مصفاة خلوية (40 ميكرومتر) على أنبوب سعة 50 مل وانقل المادة الطافية التي تحتوي على الخلايا المنفصلة إلى المرشح. يغسل ب 1 مل DMEM لتحقيق أقصى قدر من استعادة الخلايا.
قم
11. بالطرد المركزي للأنابيب عند 1,000 × جم لمدة 10 دقائق وتخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة.
12. أعد تعليق الحبيبات في وسط زراعة 300 ميكرولتر واحسب الخلايا في مقياس كثافة الدم.

< p class = "jove_title" >4. تمايز الخلايا الساتلية على بقع هلام المصفوفة خارج الخلية

1. قم بتخفيف تعليق الخلية للحصول على 1.5 × 10³ خلايا في 10 ميكرولتر من وسط الاستزراع.
2. قم بتأمين أغطية شرائح الغرفة بشريط لاصق وقم بتمييز البقع بعلامة سوداء على الجانب السفلي من زجاج الكائن.
3. باستخدام ماصة دقيقة، ضع قطرة من 10 ميكرولتر معلق الخلية على بقعة هلام المصفوفة خارج الخلية. تحقق تحت المجهر مما إذا كان قطرة تعليق الخلية قد تم وضعها بشكل صحيح على الفور. احتضن لمدة ست ساعات عند 37 درجة مئوية.
4. أضف بعناية 400 ميكرولتر من وسط الاستزراع (DMEM مكمل بنسبة 20٪ FBS و 10٪ HS و 1٪ P / S و 1٪ CEE) واحتضانه لمدة ثلاثة أيام عند 37 درجة ><مئوية. ملاحظه: في هذه المرحلة ، يتعرض SC المعزول حديثا لصدمة هائلة (الهضم الأنزيمي والخلية القاسية) ويحتاجون إلى التعافي. لا تزعج الخلايا خلال الأيام الثلاثة الأولى. بعد ذلك ، يمكن تغيير وسيط الثقافة اعتمادا على نوع التجربة.
   يمكن زرع بقع هلام المصفوفة خارج الخلية بكثافة خلوية عالية (1.5-2.5 × 10³/20 ميكرولتر) لمقايسة التمايز. يمكن استبدال وسط الاستزراع (DMEM المكمل بنسبة 20٪ FBS و 10٪ HS و 1٪ P / S و 1٪ مستخلص جنين الدجاج) كل ثلاثة أيام.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: بقع هلام المصفوفة خارج الخلية في شريحة الغرفة. (أ) لسهولة التلاعب ، ضع شريحة الغرفة المكونة من 8 آبار في طبق بتري مقاس 100 مم. Pipet 10 ميكرولتر هلام مصفوفة خارج الخلية في كل غرفة ووضعها على سطح بارد (7 دقائق). (ب) انزلاق الغرفة بعد إزالة هلام المصفوفة خارج الخلية الزائد.

< p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات إبرة تحت الجلد 25 جم
0.5 × 25 م BD ميكرولانس 300400 تشريح مقص براون بي سي 154 آر ملقط دقيق مستقيم براون 330 دينار شفرة المشرط الجراحي رقم 15 سوان مورتون 0205 الكحول 70٪ دينتيك 2,010,005 ريال بيرمانوكس سلايد، 8 غرف الترمو: العلمية 177445 6 لوحة ثقافة خلية جيدة Greiner bio-one 657160 أطباق زراعة الخلايا (100 × 20 مم) Greiner bio-one 664160 [م] 15 مل أنبوب طرد مركزي مخروطي معقم BD Biosciences 352097 50 مل أنبوب طرد مركزي مخروطي معقم BD Biosciences 352098 مصفاة الخلية (40 ميكرومتر) جيبكو هاتف: 431750 10 مل ماصة مصلية Greiner bio-one 607180 20 ميكرولتر FT20 Greiner bio-one 774288 ماتريجل ، خال من الفينول والأحمر BD Biosciences 356237 10 مل بروناز كالبيوكيم 53702 10 كيلو محلول ملحي مخزن بالفوسفات جيبكو 14190-144 500 مل Dulbecco's Modified Eagle Medium, نسبة عالية من الجلوكوز, مكمل GlutaMAX, البيروفات جيبكو هاتف: 10569-010 500 مل مصل الأبقار الجنينية فيشر ساينتيك 3600511 500 مل مصل الحصان جيبكو 26050088 500 مل البنسلين الستربتومايسين (10,000 وحدة / مل) جيبكو 15140-122 100 مل مستخلص جنين الدجاج MP الطب الحيوي 2850145 20 مل