تكوين الخلايا العصبية الناجم عن حمض الريتينويك باستخدام خلايا سرطان الفئران الجنيني

الملخص

المصدر: Leszczyński ، P. ، et al. ، تكوين الخلايا العصبية باستخدام خلايا السرطان الجنيني p19 J. Vis. Exp. (2019)

يوضح هذا الفيديو تقنية بسيطة لتكوين الخلايا العصبية الناجم عن حمض الريتينويك في خلايا سرطان الفأر الجنيني P19. ينشط حمض الريتينويك عوامل النسخ ويؤدي إلى التعبير الجيني للتمايز العصبي.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. التوليد الكلي

1. أضف 5 ميكرولتر من RA (حمض الريتينويك) (مخزون 1 ملي مولار مذاب في 99.8٪ إيثانول ، مخزن عند -20 درجة مئوية) إلى 10 مل من وسط التمايز واخلطه جيدا (التركيز النهائي 0.5 ميكرومتر RA).
   ملاحظه: RA حساس للضوء. لا يؤثر التركيز المنخفض للإيثانول على تمايز الخلايا.
2. أضف 10 مل من وسيط التمايز (مع RA) إلى طبق الاستزراع غير المعالج مقاس 100 مم (مخصص لثقافة التعليق).
3. قم بزرع 1 × 10⁶ خلايا في طبق 100 مم (مساحة سطح الطبق 56.5 سم 2).
4. ضع القارورة مع الخلايا في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة يومين لتعزيز تكوين الركام.
5. بعد يومين ، استبدل وسيط التمايز. وسط الشفط الذي يحتوي على ركام باستخدام ماصة سعة 10 مل ونقله إلى أنبوب سعة 15 مل عند RT.
6. اسمح للركام بالاستقرار بالجاذبية لمدة 1.5 دقيقة عند RT.
7. تخلص من المادة الطافية.
8. أضف 10 مل من وسط التمايز الجديد مع 0.5 ميكرومتر RA باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل.
   أنذر: لا تقم بسحب ماصة مجمعات الخلايا لأعلى ولأسفل.
9. قم بزرع الركام في طبق استزراع جديد غير معالج مقاس 100 مم (مخصص لثقافة التعليق).
10. ضع الطبق في الحاضنة (عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}) لمدة يومين.

< p class = "jove_title" >2. تفكك المجاميع

1. شفط مجاميع الخلايا باستخدام ماصة سعة 10 مل.
2. انقل الركام إلى أنبوب سعة 15 مل. اسمح لتجاميع الخلية بالاستقرار بالجاذبية لمدة 1.5 دقيقة.
3. قم بإزالة المادة الطافية.
4. اغسل الركام باستخدام DMEM وحده (خال من المصل والمضادات الحيوية).
5. اسمح لتكاميع الخلية بالاستقرار عن طريق ترسيب الجاذبية لمدة 1.5 دقيقة في RT.
6. شفط المادة الطافية وإضافة 2 مل من التربسين EDTA (0.25٪).
7. ضع مجاميع الخلية في حمام مائي (37 درجة مئوية) لمدة 10 دقائق. حرك الركام برفق كل دقيقتين عن طريق النقر باليد.
8. أوقف عملية التربسينية بإضافة 4 مل من وسط الصيانة.
9. قم بسحب الركام لأعلى ولأسفل 20 مرة باستخدام ماصة سعة 1 مل.
10. خلايا الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 200 × جم و RT.
11. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق حبيبات الخلية في 5 مل من وسط الصيانة.
12. حدد رقم الخلية باستخدام عداد الخلايا.

< p class = "jove_title" >3. خلايا الطلاء

1. أضف 3 مل لكل بئر من وسط الصيانة إلى طبق 6 آبار.
2. خلايا البذور في صفيحة الاستزراع المكونة من 6 آبار بكثافة 0.5 × 10⁶ / بئر.
3. احتضان عند 37 درجة مئوية بتركيز 5٪ CO₂.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات DMEM نسبة عالية من الجلوكوز (4.5 جم/لتر) مع L-glutamine لونزا BE12-604Q الإيثانول 99.8٪ تشيمبور كيمياء *613964202 مصل الأبقار الجنينية (FBS) يورو E5050-03 البنسلين / الستربتومايسين 10 كيلو / 10 كيلو لونزا DE17-602E محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، مركز 1x بدون أيونات الكالسيوم والمغنيسيوم لونزا BE17- 517Q حمض الريتينويك سيجما- ألدريتش R2625-50 ملغ مذاب في 99.8٪ إيثانول ؛ يحفظ في -20 درجة مئوية حتى 6 أشهر التربسين 0.25٪ - EDTA في HBSS ، بدون أيونات الكالسيوم والمغنيسيوم ، مع الفينول الأحمر بيوسيرا LM-T1720/500 1 مل ماصات مصلية البروفيلاب 515.01 دولار 10 مل ماصات مصلية البروفيلاب 515.1 دولار طبق 100 مم مخصص لثقافة التعليق كورنينج C351029 أنابيب الطرد المركزي 15 مل سيجما- ألدريتش CLS430791-500 إيه 5 مل ماصات مصلية البروفيلاب 515.05 دولار 6 آبار لوحة كورنينج CLS3516 قوارير زراعة الخلايا ، مساحة السطح 25 سم مربع سيجما- ألدريتش CLS430639-200 إيه