$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >
1. ثقافة الخلايا الليفية الجنينية للفأر (MEFs)
- تحضير وسط MEF ، وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM ، نسبة عالية من الجلوكوز) ، مكمل بمصل بقري الجنين بنسبة 15٪ (FBS).
- قم بتغطية أطباق زراعة الخلايا مقاس 100 مم بمحلول جيلاتين 0.5٪ لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
- عد MEFs باستخدام مقياس الخلوي. قم بإزالة محلول الجيلاتين واسكب على الفور وسط MEF دافئا مسبقا إلى 37 درجة مئوية. قم بإذابة قوارير MEFs المعالجة بالميتومايسين C بسرعة في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، ثم قم بإذابة 2.8 × 106 MEFs لكل طبق مغطى بالجيلاتين 100 مم. اضبط رقم الخلية وفقا لذلك إذا كنت تستخدم أطباق بأحجام أخرى. احتضان MEFs بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
- قم بتغيير الوسيط في اليوم التالي. استزراع لمدة 2-3 أيام حتى تتلاقى طبقة MEF.
2. الخلايا الجذعية الجنينية للفأر أو ثقافة ESC
- تحضير وسط ESC ، وسيط Dulbecco المعدل (IMDM) من Iscove مكمل بنسبة 15٪ FBS و 103 U / مل عامل مثبط لسرطان الدم (LIF) ، 0.1 ملي مولار من الأحماض الأمينية غير الأساسية ، 55 ملي مولار 2-ميركابتو إيثانول ، بنسلين (100 وحدة / مل) ، ستربتومايسين (100 ميكروغرام / مل) ، جنتاميسين (200 ميكروغرام / مل) ، ومضاد حيوي للميكوبلازما 0.2٪.
- قم بإزالة وسط MEF من الطبق المحضر في الخطوة 1 واستبدله بوسط ESC مسخن مسبقا بدرجة حرارة 37 درجة مئوية.
- قم بإذابة قارورة ESC وخلايا البذور فوق طبقة MEF. احتضن عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2 ، حتى تصل الخلايا الجذعية الجذعية إلى التقاء.
- قم بإعداد أطباق زراعة الخلايا الجديدة التي تحتوي على طبقة أحادية متجمعة من MEFs. لتمرير ESCs ، اغسل مرة واحدة باستخدام PBS وافصله باستخدام 0.25٪ تريبسين / EDTA لمدة 2-5 دقائق عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2. أوقف التربسينية عن طريق إضافة IMDM جديد مع 15٪ FBS إلى الخلايا المنفصلة ، ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب 15 مل ، وجهاز طرد مركزي عند 160 × جم لمدة 5 دقائق في RT.
- قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا الجذعية الجذعية باستخدام IMDM الطازج ، وقم بتمرير خمس الخلايا إلى كل طبق جديد مغطى ب MEF ؛ احتضن حتى تصل الخلايا إلى التقاء (عادة 4-5 أيام).
3. سحب MEFs وزراعة ESCs على الألواح المطلية بالجيلاتين
- بمجرد أن تصل ECSs إلى التقاء ، افصلها و MEFs مع 0.25٪ Trypsin / EDTA كما في الخطوة 2.4 ، وأعد تعليق الخلايا في IMDM الطازج ، وانقلها إلى طبق بتري بكتريولوجي غير لاصق ، واحتضانها لمدة 40 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
- انقل المحطات الكهربية الجذعية والمتوسطة المحتوية على MEFs بعناية إلى صفيحة جديدة مطلية بالجيلاتين باستخدام ماصة سعة 5 مل، وتجنب سحب العينات المتكرر. الخلايا المتبقية في أطباق بتري هي MEFs لأن الخلايا الجذعية الكينية لا تلتصق.
- قم بتمرير ESCs كل 3-4 أيام. قد يقلل التمرير الأقل تكرارا من تعدد القدرات ESC. لا تتجاوز 60٪ من التقاء ، لأنها قد تفضل التمايز.
- كرر الخطوات 3.2-3.3 ثلاث مرات أو أكثر ، حسب الحاجة ، حتى لا يمكن اكتشاف MEFs بواسطة مجهر زراعة الخلايا ، باستخدام هدف 20X ، للتأكد من عدم وجود MEFs.
- تحقق من تعدد القدرات ESC عن طريق التحقق من ثقافة ESC لمعرفة ما إذا كانت الخلايا تشكل مستعمرات كثيفة مع مورفولوجيا متعددة الأضلاع ESC نموذجية (الشكل 1 أ). اختبار جذع الخلية عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي الكمي (qRT-PCR) ، أو النشاف المناعي ، أو التألق المناعي لعوامل النسخ الأساسية متعددة القدرات (الشكل 2).
< p class = "jove_title" >
4. تشكيل EB
- قم بإعداد محلول مخزون كامل عبر RA عند 10 ملي مولار في DMSO وقم بتقسيمه إلى أنابيب ميكرو فوج محمية بالضوء سعة 1.5 مل. المحلول مستقر عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين. احميها من الضوء.
- قم بتدوير ESCs كما في الخطوة 2.4 ؛ أعد الطلاء في IMDM جديد بدون LIF كتعليق أحادي الخلية.
- عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم ، وقم بإعداد تعليق 5 × 105 خلايا / مل في IMDM مع 0.5 ميكرومتر RA.
- اللوحة 100 قطرة 20 ميكرولتر لكل طبق بتري مقاس 100 مم مع ماصة ذات 8 قنوات وأطراف 200 ميكرولتر، اقلب الأطباق واملأ الغطاء المقلوب ب PBS لمنع القطرات المعلقة من الجفاف. حماية وسائط الثقافة المحتوية على RA من الضوء.
- استزراع EBs في قطرات معلقة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2 ، لمدة 4 أيام.
