اختبار النخاع الناجم عن التنبيغ في المختبر لخلايا سلائف الخلايا قليلة التغصن

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Peckham ، H. M. ، et al. إنتاج واستخدام الفيروس العدسي لنقل الخلايا السليفة الأولية قليلة التغصن بشكل انتقائي لمقايسات النخاع في المختبر. J. Vis. Exp. (2015).

يوضح الفيديو بروتوكولا لتفريق الخلايا السليفة قليلة التغصن (OPCs) إلى خلايا الدبقية قليلة التغصن وإحداث تكوين النخاع في ثقافة مشتركة مع الخلايا العصبية العقدية الجذرية الظهرية (DRG). يتم تحويل OPCs بنواقل الفيروسية العدسية التي تشفر بروتين إشارات ينظم تكوين النخاع. يتم استزراع OPCs المنقولة بشكل مشترك مع الخلايا العصبية DRG لتقييم التمايز إلى الخلايا قليلة التغصن وتكوين النخاع الناجم عن البروتين الإرشادي.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. استنساخ 2K7 Lentivector

1. قبل استنساخ الجين محل الاهتمام في ناقل الفيروس العدسي 2K7 ، قم باستنساخ الجين إلى ناقل pENTR (3637 نقطة أساس ، مقاوم للكاناميسين) باستخدام التقنيات الجزيئية القياسية. استخدم مواقع تقييد EcoRI و SacII للاستنساخ الفرعي.
2. تضخيم 2K7 Lentivector
   1. قم بتحويل الحمض النووي 2K7 lentivector عن طريق خلط 100 نانوغرام من الحمض النووي البلازميد برفق مع الخلايا المختصة ، واحتضانه على الجليد لمدة 30 دقيقة.
   2. يختلط الحمض النووي / الخلايا المختصة للصدمة الحرارية عند 42 درجة مئوية لمدة 90 ثانية وتضعها على ألواح LB-Agar تحتوي على كل من الأمبيسلين (100 ميكروغرام / مل) والكلورامفينيكول (15 ميكروغرام / م....

النتائج

p class = "jove_content" > الجدول 1. جدول حلول المخزون.

اسم المكونات تلاحظ TE عازلة درجة الحموضة 8 10 ملي تريس درجة الحموضة 8
1 ملي مولار EDTA درجة الحموضة 8 مكياج في ماء منزوع الأيونات. بولي إيثيلينيمين (PEI) 1 جم / لتر قم بالمكياج بالم.......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 2K7 العدسات هدية طيبة من الدكتور سوتر 5-فلورو-2 ′-ديوكسيوريدين سيجما ألدريتش F0503-100 ملغ أمبيسلين سيجما ألدريتش أ 9518-5 جي B27 - مكمل عصبي NeuroCul SM1 تقنيات الخلايا الجذعية 5711 م BDNF (إنسان) بيبروتك PT450021000 البيوتين (د-بيوتين) سيجما ألدريتش ب 4639 جيش صرب البوسنه سيجما ألدريتش أ 4161 كلورامفينيكول سيجما ألدريتش C0378-100G CNTF بيبروتك 450-13020 وسائط تركيب الفلور DAKO داكو S302380-2 DMEM، نسبة عالية من الجلوكوز، البيروفات، بدون جلوتامين تقنيات الحياة 10313039 DNase سيجما ألدريتش د5025-375 كيلو DPBS تقنيات الحياة 14190250 DPBS ، كالسيوم ، مغنيسيوم تقنيات الحياة 14040182 EBSS تقنيات الحياة 14155063 EcoRI-HF NEB R3101 نواقل الدخول للمروج والجين ذي الأهمية الإنشاء وفقا للبروتوكولات 1-2 مصل الأبقار الجنينية سيجما ألدريتش 12003 ج فورسكولين سيجما ألدريتش F6886-50 ملغ الجلوكوز (D-الجلوكوز) سيجما ألدريتش جي 7528 الجلسرين توريد الكيماويات GL010-500M انظر حلول المخزون