اختبار النخاع الناجم عن التنبيغ في المختبر لخلايا سلائف الخلايا قليلة التغصن

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Peckham ، H. M. ، et al. إنتاج واستخدام الفيروس العدسي لنقل الخلايا السليفة الأولية قليلة التغصن بشكل انتقائي لمقايسات النخاع في المختبر. J. Vis. Exp. (2015).

يوضح الفيديو بروتوكولا لتفريق الخلايا السليفة قليلة التغصن (OPCs) إلى خلايا الدبقية قليلة التغصن وإحداث تكوين النخاع في ثقافة مشتركة مع الخلايا العصبية العقدية الجذرية الظهرية (DRG). يتم تحويل OPCs بنواقل الفيروسية العدسية التي تشفر بروتين إشارات ينظم تكوين النخاع. يتم استزراع OPCs المنقولة بشكل مشترك مع الخلايا العصبية DRG لتقييم التمايز إلى الخلايا قليلة التغصن وتكوين النخاع الناجم عن البروتين الإرشادي.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. استنساخ 2K7 Lentivector

1. قبل استنساخ الجين محل الاهتمام في ناقل الفيروس العدسي 2K7 ، قم باستنساخ الجين إلى ناقل pENTR (3637 نقطة أساس ، مقاوم للكاناميسين) باستخدام التقنيات الجزيئية القياسية. استخدم مواقع تقييد EcoRI و SacII للاستنساخ الفرعي.
2. تضخيم 2K7 Lentivector
   1. قم بتحويل الحمض النووي 2K7 lentivector عن طريق خلط 100 نانوغرام من الحمض النووي البلازميد برفق مع الخلايا المختصة ، واحتضانه على الجليد لمدة 30 دقيقة.
   2. يختلط الحمض النووي / الخلايا المختصة للصدمة الحرارية عند 42 درجة مئوية لمدة 90 ثانية وتضعها على ألواح LB-Agar تحتوي على كل من الأمبيسلين (100 ميكروغرام / مل) والكلورامفينيكول (15 ميكروغرام / مل) عند 37 درجة مئوية لمدة 16-18 ساعة < / > ملاحظة: يستخدم الكلورامفينيكول لمنع إعادة التركيب بين التكرارات الطرفية الطويلة.
   3. في اليوم التالي ، قم بزراعة المستنسخة البكتيرية المختارة في وسائط Luria-Bertani (LB) التي تحتوي على كل من الأمبيسلين (100 ميكروغرام / مل) والكلورامفينيكول (15 ميكروغرام / مل) عند 37 درجة مئوية لمدة 16-18 ساعة.
3. الاستنساخ الفرعي من متجه pENTR إلى 2K7 Lentivector (الشكل 1).
   1. أضف ما يلي إلى أنبوب سعة 1.5 مل واخلطه برفق: L4-R1 pENTR-pDNOR-CMV (مروج) (60 bng) 1-2.5 ميكرولتر L1-L2 pENTR4IRES2GFP (مع الجين ذي الأهمية) (80 bng) 1-2.5 ميكرولتر K7 lentivector (80 نانوغرام / ميكرولتر) 1 ميكرولتر TE-buffer ، درجة الحموضة 82-5 ميكرولتر ، إجمالي 8 ميكرولتر.
   2. قم بإزالة مزيج إنزيم كلوناز من -80 درجة مئوية وقم بإذابة الثلج على الثلج لمدة دقيقتين. تأكد من أن هذا الإنزيم عبارة عن حصة جديدة من -80 درجة مئوية لأن الإنزيم قد قلل بشكل كبير من كفاءة الاستنساخ مع دورات التجميد والذوبان المتكررة
   3. أضف 2 ميكرولتر من الإنزيم لكل تفاعل واخلطه جيدا عبر الدوامة ، واحتضن خليط تفاعل كلوناز عند 23-25 درجة مئوية لمدة 6-24 ساعة.
   4. أضف 1 ميكرولتر من محلول البروتيناز K (المرفق بمجموعة الإنزيم) إلى خليط تفاعل كلوناز واحتضنه لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية.
   5. قم بتحويل خليط تفاعل كلوناز إلى خلايا مختصة وقم بزراعة المستعمرات المختارة في وسائط LB التي تحتوي على أمبيسلين (100 ميكروغرام / مل) عند 37 درجة مئوية لمدة 16-18 ساعة.
   6. استخراج وتنقية الحمض النووي باستخدام مجموعة أدوات Miniprep للحمض النووي البلازميد التجارية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
   7. تأكد من الحمض النووي عن طريق الهضم باستخدام إنزيمات التقييد Spe I و Sac II ومخزن مؤقت مناسب وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لإزالة الجزء الذي يحتوي على المحفز والجين ذي الأهمية.
      ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية للتحقق مما إذا كان الحمض النووي المستنسخ يحتوي على جين الإدخال الصحيح ذي الأهمية مع العمود الفقري الصحيح للمتجه. حجم المتجه نفسه بدون الجزء المدرج هو 6.7 كيلو بايت. يتضمن حجم الجزء الذي تم إدخاله الذي تم إدخاله كلا من المروج والجين المطلوب المثير للاهتمام. احسب أحجام الأجزاء المتوقعة من الملخص للجين المحدد عبر برنامج تحرير تسلسل الحمض النووي ، على سبيل المثال ، محرر البلازميد APE-A.
   8. تحقق من أحجام كل من العمود الفقري لناقل الحمض النووي والجزء الذي تم إطلاقه عن طريق تشغيل هلام الاغاروز بنسبة 1٪ في 1x TAE buffer (انظر الجدول 1) عند 100 فولت.
   9. تضخيم الحمض النووي المؤكد عن طريق زراعة البكتيريا في 500 مل من وسائط LB التي تحتوي على أمبيسلين (100 ميكروغرام / مل) عند 37 درجة مئوية لمدة 16-18 ساعة.
   10. استخراج وتنقية الحمض النووي باستخدام مجموعة البلازميد التجاري للحمض النووي Maxiprep وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
       ملاحظه: يولد Maxiprep عادة كمية كافية من الحمض النووي المطلوب لإنتاج الفيروس.
4. كرر الخطوات 1.3.9-1.3.10 لتضخيم الحمض النووي التالي للمستحضرات الفيروسية العسسية: ناقل المغلف (PMD2. G ، 6.1 كيلو بايت) ، ناقل العبوة (pBR8.91 ، 12.5 كيلو بايت) ، وناقل فيروسي فارغ كعنصر تحكم (GFP-CMV-2K7 ، 8.7 كيلو بايت).

فئة

2. إنتاج الفيروسات 2K7

ملاحظة: اليوم 1:

1. في يوم التعدي ، لوحة 32 مليون HEK293 خلية تائية في قارورة T175 تحتوي على 25 مل من وسائط الخلايا التائية للكلية الجنينية البشرية (HEK) 293 (انظر الجدول 1). بدلا من ذلك ، قم بلوحة 16 مليون خلية في اليوم السابق للتعدي إذا كان الوقت ضيقا في يوم التعدي.
   ملاحظه: يمكن أن يكون التعدي ناجحا بنفس القدر عن طريق طلاء الخلايا في يوم التعدي أو قبل اليوم. باستخدام أي من البديلين ، فإن النقطة الحاسمة هنا هي التأكد من أن الخلايا عالقة على سطح طبق المزرعة قبل التعدي.
   ملاحظه: اليوم 2:
2. تعداء
   1. قبل التعدي ، قم بتخفيف الحمض النووي إلى 1 ميكروغرام / ميكرولتر في حمض Tris-ethylenediaminetetraacetic Buffer الذي يحتوي على 10 ملي مولار من الرقم الهيدروجيني Tris 8 ، 1 ملي مولار EDTA الرقم الهيدروجيني 8 في الماء منزوع الأيونات.
   2. في أنبوب سعة 50 مل ، قم بإعداد مزيج رئيسي (الجدول 2) للتعداء في قارورة T175. أضف الحمض النووي إلى وسط النسر المعدل من Dulbecco الدافئ مسبقا (DMEM) واخلطه جيدا بواسطة الدوامة ، ثم أضف البولي إيثيلين المعقم (PEI) (انظر الجدول 1 لتجنب هطول الأمطار المبكر.
   3. تخلط جيدا عن طريق قلب الأنبوب 3-4x ، وتحتضن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
   4. قم بإجراء تغيير كامل للوسائط على HEK293T الخلايا. استنشق وسائط المزرعة من الخلايا تماما وتغذي بوسائط زراعة خلايا HEK293T الدافئة مسبقا (25 مل لكل قارورة T175).
   5. أضف خليط التعداء (خليط الحمض النووي / PEI) بالتنقيط إلى الخلايا أحادية الطبقة. تحرك برفق للخلط جيدا واحتضان الخلايا المنقولة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، بين عشية وضحاها.
      ملاحظة: اليوم 3:
   6. لضمان نجاح التعدي ، تحقق من تعبير البروتين الفلوري الأخضر (GFP) بعد 24 ساعة من التعدي عبر المجهر الفلوري.
      ملاحظه: تشير أكثر من 50٪ من الخلايا التي تعبر عن GFP عادة إلى تعداء جيد.
      ملاحظه: اليوم 4:
3. بعد 48 ساعة من التعدي ، اجمع المادة الطافية الفيروسية واستبدلها بوسائط HEK293 T جديدة (25 مل لكل قارورة T175).
   1. جهاز الطرد المركزي للطافي الفيروسي عند 1،140 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لإزالة بقايا الخلية من المادة الطافية. انقل المادة الطافية التي تم تطهيرها إلى أنبوب سعة 50 مل وقم بتخزينها عند 4 درجات مئوية
      ملاحظة: اليوم 5:
4. بعد 72 ساعة من التعدي ، اجمع الدفعة الثانية من المادة الطافية الفيروسية. كرر الخطوة 2.3.1 وتجمع 48 و 72 ساعة من المواد الطاحفية التي تم تطهيرها.
5. لتركيز الفيروس ، قم بالطاف الفيروسي بالطرد المركزي عند 170,000 × جم لمدة 90 دقيقة عند 4 درجات مئوية باستخدام أنابيب الطرد المركزي الفائق سعة 30 مل.
6. تخلص من المادة الطافية وكرر الخطوة 2.6 حتى يتم طرد كل المادة الطافية التي تم تطهيرها تاركة حبيبات (غير مرئية) من الفيروس بالإضافة إلى PEI المترسب في قاعدة الأنبوب.
7. لتعليق الفيروس ، أضف 500 ميكرولتر من وسائط SATO (انظر الجدول 1) إلى أنابيب أجهزة الطرد المركزي الفائقة. قم بتدوير الدوامة لمدة 30 ثانية واكشط قاعدة الأنبوب بطرف ماصة لفك الفيروس ميكانيكيا. كرر هذه الخطوة 6x لتفقد الحبيبات الفيروسية.
8. قم بتجميع الفيروس المعلق في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة وتدور لفترة وجيزة جدا لإزالة PEI غير القابلة للذوبان. قم بتصفية المادة الطافية من خلال مرشح 0.45 ميكرومتر لإزالة البروتينات.
9. ينقل الفيروس إلى 20 ميكرولتر و 50 ميكرولتر و 100 ميكرولتر ويخزن في -80 درجة مئوية.

< p class = "jove_title" >3. تحويل OPCs

1. ثقافة OPCs الأولية في وسائط SATO (10 مل / 10 سم لوحة) مع عامل التغذية العصبية الهدبية (CNTF ، 10 نانوغرام / مل) ، عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية (PDGF ، 10 نانوغرام / مل) ، نيوتروفين 3 (NT3 ، 1 نانوغرام / مل) ، وفورسكولين (4.2 ميكروغرام / مل) عند 37 درجة مئوية ، 8٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 24 ساعة بعد التشريح.
2. استنشق تماما من وسائط زراعة OPC ، وقم بتغذية الخلايا بوسائط SATO الطازجة (10 مل) مع عوامل النمو (انظر أعلاه في الخطوة 3.1).
3. إضافة فيروس إلى OPCs إلى التركيز الأمثل, زراعة OPCs لمزيد من 48 ساعة.

< p class = "jove_title" >4. بذر OPC للثقافات المشتركة النخاعية (الشكل 2)

1. لإزالة OPCs من السطح ، اشطف أولا ألواح OPC بمحلول ملح إيرل المتوازن (EBSS) سعة 8 مل مرتين ، ثم احتضن الخلايا ب 5 مل من 0.05٪ Trypsin-EDTA المخفف بنسبة 1:10 مع EBSS عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين.
2. قم بتحييد التربسين باستخدام 30٪ FBS في EBSS (5 مل) وإزالة الخلايا من الصفيحة عن طريق سحب العينات. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب سعة 15 مل ، وجهاز طرد مركزي عند 180 × جم لمدة 15 دقيقة في RT.
3. استنشق المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من وسائط SATO الدافئة مسبقا متبوعة بعدد الخلايا.
4. قبل بذر OPC ، قم بشفط الوسائط بالكامل من لوحة ثقافة DRG. بذرة 200,000 OPCs بلطف على الخلايا العصبية DRG كما هو موضح سابقا.
   ملاحظه: يجب أن يكون إجمالي حجم بذر OPC أقل من 200 ميكرولتر لكل غطاء 22 مم.
5. اترك الخلايا لتستقر دون تحريك اللوحة لمدة 10 دقائق في غطاء مزرعة الأنسجة ، ثم قم بتعبئة 1 مل من وسائط SATO الدافئة مسبقا لكل بئر.
6. أعد طلاء OPCs الشقيقة المتبقية مع وسائط SATO مع عوامل النمو (انظر الخطوة 6.1). استخدم هذه OPCs الشقيقة للتحقق من التعبير عن البروتين محل الاهتمام.
7. بعد 24 ساعة ، استبدل وسائط SATO بوسائط الزراعة المشتركة (2 مل / بئر) التي تحتوي على وسائط SATO (بدون عوامل) والعصبية القاعدية (v / v) ب 1٪ B2حافظ على المزارع المشتركة لمدة 14 يوما مع تغيير الوسائط كل 2-3 أيام.
8. تقييم الثقافات المشتركة للتعبير عن بروتين المايلين عن طريق تحليل اللطخة الغربية وتصور تكوين الأجزاء المحورية النخاعية عن طريق تلطيخ مناعي مزدوج بالأجسام المضادة ضد علامات البروتين الأساسي للمايلين والعلامات العصبية.

النتائج

p class = "jove_content" > الجدول 1. جدول حلول المخزون.

اسم المكونات تلاحظ TE عازلة درجة الحموضة 8 10 ملي تريس درجة الحموضة 8
1 ملي مولار EDTA درجة الحموضة 8 مكياج في ماء منزوع الأيونات. بولي إيثيلينيمين (PEI) 1 جم / لتر قم بالمكياج بالم...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 2K7 العدسات هدية طيبة من الدكتور سوتر 5-فلورو-2 ′-ديوكسيوريدين سيجما ألدريتش F0503-100 ملغ أمبيسلين سيجما ألدريتش أ 9518-5 جي B27 - مكمل عصبي NeuroCul SM1 تقنيات الخلايا الجذعية 5711 م BDNF (إنسان) بيبروتك PT450021000 البيوتين (د-بيوتين) سيجما ألدريتش ب 4639 جيش صرب البوسنه سيجما ألدريتش أ 4161 كلورامفينيكول سيجما ألدريتش C0378-100G CNTF بيبروتك 450-13020 وسائط تركيب الفلور DAKO داكو S302380-2 DMEM، نسبة عالية من الجلوكوز، البيروفات، بدون جلوتامين تقنيات الحياة 10313039 DNase سيجما ألدريتش د5025-375 كيلو DPBS تقنيات الحياة 14190250 DPBS ، كالسيوم ، مغنيسيوم تقنيات الحياة 14040182 EBSS تقنيات الحياة 14155063 EcoRI-HF NEB R3101 نواقل الدخول للمروج والجين ذي الأهمية الإنشاء وفقا للبروتوكولات 1-2 مصل الأبقار الجنينية سيجما ألدريتش 12003 ج فورسكولين سيجما ألدريتش F6886-50 ملغ الجلوكوز (D-الجلوكوز) سيجما ألدريتش جي 7528 الجلسرين توريد الكيماويات GL010-500M انظر حلول المخزون