عزل الخلايا العصبية المصنفة بالفلورسنت من دماغ الفئران

الملخص

المصدر: Paul ، A. ، et al. ، تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لخلايا الفأر العصبية المصنفة فلورسنت باستخدام الفرز اليدوي والنسخ المزدوج في المختبر مع تسلسل العدد المطلق (DIVA-seq). J. Vis. إكسب. (2018)

يوضح هذا الفيديو طريقة لعزل الخلايا العصبية المصنفة بالفلورسنت من دماغ الفأر.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

1. الفرز اليدوي للخلايا العصبية الفئرانية المصنفة فلورسنت

1. اسحب الشعيرات الدموية الدقيقة الزجاجية (انظر جدول المواد) إلى قطر خروج 10-15 ميكرومتر باستخدام مجتذب شعري بالإعدادات التالية: الحرارة: 508 ، السحب: فارغ ، vel: فارغ ، الوقت: فارغ.
2. قم بتوصيل أنابيب سيليكون مرنة مقاس 120-150 سم (~ 0.8 مم بقطر داخلي) بمرشح حقنة غشائي ثنائي فلوريد البولي فينيلدين (PVDF) 0.2 ميكرومتر وصمام أنابيب ثنائي الاتجاه باستخدام موصلات أنابيب مناسبة.
3. قم بإعداد 500 مل من السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي المبرد (4 درجات مئوية) (ACSF ، الجدول 1) ، والأكسجين عن طريق فقاعات 5٪ من الأكسجين المتوازن لثاني أكسيد الكربون من خلال حجر هوائي لمدة 15 دقيقة أو حتى يزول المحلول تماما.
4. قم بإعداد 100 مل من ACSF مع مزيج من حاصرات النشاط في دورق سعة 150 مل (الجدول 1).
5. تحضير 100 مل من ACSF مع 1 مجم / مل من البروتياز الرابع من المكورات العقدية في دورق 150 مل (الجدول 1).
6. تحضير 100 مل من ACSF مع محلول مصل بقري جنيني 1٪ (FBS) في دورق 150 مل وأكسجين بأكسجين متوازن بثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ من خلال حجر الهواء.
7. قم بتشريح الدماغ من فأر قتل رحيم عن طريق فتح الجمجمة بمقص صغير واستخراج الدماغ الجديد باستخدام ملقط دقيق دون الإضرار بالقشرة.
   ملاحظه: يمكن استخدام الفئران من أي سلالة وعمر وجنس حسب الرغبة. لا تجمد الدماغ أو قم بإجراء الفرز اليدوي على الفئران المحقونة بفيروسات أو غيرها من العوامل الخطرة / المعدية.
8. حافظ على الدماغ في ACSF المبرد والأكسجين ، مع ترك حجر هوائي متصل ب 5٪ من الأكسجين المتوازن لثاني أكسيد الكربون خلال مدة التقسيم بأكملها.
9. ضع الدماغ على ظرف الاهتزاز وقم بقطع الأقسام الإكليلية أو السهمية بسماكة 300 ميكرومتر. اجمع أكبر عدد ممكن من الأقسام حسب الحاجة للحصول على ما لا يقل عن ~ 10-50 خلية مصنفة تصل إلى عدة مئات من الخلايا. ضعي الشرائح على حامل شرائح قطني شبكي ، وضعيها داخل دورق حتى يتم غمرها في ACSF المؤكسج.
10. انقل الشرائح الطازجة إلى دورق يحتوي على ACSF مع حاصرات النشاط وقم بتثبيتها لمدة 15-20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. استمر في فقاعات الأكسجين باستخدام حجر الهواء.
11. انقل الشرائح إلى دورق يحتوي على ACSF مع محلول البروتياز لإجراء عملية هضم خفيفة في درجة حرارة الغرفة: 20-30 دقيقة للحيوانات P4-14 أو ما يصل إلى 45-60 دقيقة للحيوانات P28-56. استمر في فقاعات الأكسجين.
12. اغسل ACSF بالبروتياز عن طريق تحريك الشرائح مرة أخرى إلى الدورق الذي يحتوي على ACSF مع محلول حاصرات النشاط لمدة 5-10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. استمر في فقاعات الأكسجين.
13. انقل الأقسام الفردية إلى طبق بتري مقاس 100 مم يحتوي على ACSF مع 1٪ FBS في درجة حرارة الغرفة. تحت نطاق تشريح الفلورسنت ، تحتوي مناطق التشريح الدقيق والطبقات ذات الأهمية على ما لا يقل عن 10-50 خلية (حتى بضع مئات). قم بإجراء التشريح الدقيق باستخدام زوج من الملقط الدقيق أو عن طريق ربط إبر حقن 22-28 جم على حوامل خشبية (أسياخ).
14. باستخدام ماصة باستور، انقل القطع التي تم تشريحها إلى أنبوب ميكرو فوج سعة 2 مل يحتوي على ~0.8 مل من FBS 1٪ في محلول ACSF.
15. ثلاثي الأنسجة المقطعة في أنبوب الطرد الدقيق في درجة حرارة الغرفة. اصنع ثلاث ماصات باستور طويلة الساق بأقطار خروج متناقصة عن طريق لفها على لهب مكشوف. قم بأداء ~ 10 ضربات مع كل ماصة ، بدءا من الأكبر وتنتهي بالأصغر
16. قم بتوزيع الخلايا المنفصلة في طبق بتري مقاس 100 مم يحتوي على ACSF المؤكسج (يمكن طلاء طبق بتري بشكل رقيق ب 5 مم من أجار 1٪ أو مركب سيليكون شفاف بنسبة 1:10 ، إذا رغبت في ذلك). يحفظ في درجة حرارة الغرفة.
17. انتظر ~ 5-7 دقائق حتى تستقر الخلايا تدريجيا ، ثم راقب إشارة GFP / RFP تحت مجهر التشريح.
    ملاحظه: ستكون الخلايا المفردة والحطام والكتل الصغيرة مرئية في المجال الساطع (BF).
18. اختر 10-15 خلية GFP / RFP في المرة الواحدة باستخدام ماصة شعرية (من الخطوة 1.1) متصلة بأنابيب سيليكون مرنة (قطر داخلي 0.4-0.8 مم) وقم بتوزيع الخلايا في طبق بتري مقاس 100 مم يحتوي على ACSF مؤكسج طازج.
19. عن طريق سد نهاية صمام الأنبوب باللسان ، ضع الشعيرات الدموية بالقرب من الخلية محل الاهتمام. التقط الخلايا باستخدام عمل الشعيرات الدموية عند تخفيف الكتلة، وقم بحظرها بسرعة مرة أخرى لمنع دخول السوائل الزائدة إلى الماصة. قم بتوزيع الخلايا على طبق بتري مقاس 100 مم مع ACSF المؤكسج الطازج عن طريق النفخ برفق ، مع مراقبة الطرف الشعري تحت بصريات مضان لمجهر التشريح. تهدف إلى جمع ~ 100-150 خلية إجمالا.
20. كرر الخطوة 1.19 مرة أو مرتين أخريين (حسب الحطام) وانقل ما مجموعه ~50-75 خلية إلى طبق بتري جديد مقاس 100 مم ، مع التأكد من أن الملوثات مثل الحطام ضئيلة في بصريات تباين التداخل التفاضلي للمجال الساطع (DIC).

الجدول 1: قائمة الحلول والمخازن المؤقتة.

مخزن مؤقت بند تركيز الكمية (ميكرولتر) المخزن المؤقت لجمع العينات مثبط الريبونوكلياز المؤتلف 55 RCC 1: 50 كيلو مخفف 110 ماء خال من النوكلياز 605 ريال Aliquot 43.75 ميكرولتر من أعلاه في 16 أنبوبا (شريطان من 8 ؛ 200 ميكرولتر أنابيب PCR) ؛ أضف ما يلي لكل أنبوب بادئات UMI (مثل N10B1-N10B16) 1 نانوغرام / ميكرولتر 6.25 ميكرولتر / أنبوب الحجم النهائي في كل أنبوب 50 ميكرولتر (يمكن تقسيم كل أنبوب إلى 25 ميكرولتر وتجميده عند -80 درجة مئوية) محاليل: بند تركيز مبلغ CSF: لجعل 5 لتر تذوب كلوريد الصوديوم 126 ملم 36.8 جرام كيه سي إل 3 مللي متر 1.15 جرام NaH₂PO₄ 1.25 ملي 0.75 جرام NaHCO₃ 20 ملم 8.4 جرام إلى 500 مل من ACSF ، فقاعة الأكسجين لمدة 10-15 دقيقة ثم أضف ما يلي طازجا في كل مرة: د-الجلوكوز 20 ملم 1.8 جرام MgSO₄ 2 مللي 0.5 مل من مخزون 4 M كلوريد_{الهواء 2} 2 مللي 0.5 مل من مخزون 4 M حافظ على أكسجة ACSF من جميع الخارج محاليل: بند التركيز كوكتيل مانع النشاط: اصنع مخزونا 100x إلى 100 مل من ACSF أضف APV 0.05 ملي CNQX 0.02 ملي تي تي إكس 0.0001 ملي مولار (0.1 ميكرومتر) محاليل: بند مبلغ ذوبان البروتياز (100 مل) البروتياز من Streptomyces griseus 100 مجم مصل الأبقار الجنينية: مصدر تجاري ، aliquot في 500 ميكرولتر لكل استخدام.

المواد