Method Article

طريقة لتوليد وسيط مكيف بالخلايا قليلة التغصن

July 8th, 2025

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Mazuir, E., et al. جيل من الخلايا قليلة التغصن والوسط المشروط بالخلايا قليلة التغصن لتجارب الثقافة المشتركة. J. Vis. Exp. (2020)

يوضح هذا الفيديو إنتاج الوسط المكيف بالخلايا قليلة التغصن (OCM) من خلايا سلالة الخلايا قليلة التغصن من خلال التأكيد عليها لتعزيز إطلاقها الجزيئي في الوسط. يمكن إضافة هذه الوسيطة ، الغنية بعوامل النمو والسيتوكينات والجزيئات النشطة بيولوجيا الأخرى ، إلى مزارع الخلايا العصبية لاكتساب نظرة ثاقبة لتأثير العوامل التي تفرز الخلايا قليلة التغصن على فسيولوجيا الخلايا العصبية والاتصال.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >1. حصاد الخلايا OL (OL) وثقافتها

ملاحظة: يجب تنفيذ هذه الخطوات في غطاء التدفق الصفحي في ظل ظروف معقمة.

  1. في اليوم التالي للاهتزاز ، قم بإعداد وسط Bottenstein-Sato (BS) وفقا للجدول 1.
  2. اشطف أطباق بتري المطلية 3 مرات بالماء المقطر المعقم.
  3. حصاد قوارير طافية تحتوي بشكل أساسي على خلايا سلالة OL ولكن أيضا بعض الخلايا الدبقية الصغيرة وقم بوضعها على أطباق بتري غير المطلية 100 مم.
    ملاحظه: تسمح هذه الخطوة بإزالة الخلايا الدبقية الصغيرة من خلال التصاق سريع تفاضلي على سطح الطبق.
  4. احتضن أطباق بتري لمدة 15 دقيقة في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
  5. املأ كل قارورة T150 ب 25 مل من وسط الاستزراع الدافئ الطازج واحتضنه في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 حتى الرج الثاني.
  6. انقل المادة الطافية من أطباق بتري إلى أطباق بتري جديدة غير مطلية مقاس 100 مم للسماح بالتصاق الخلايا الدبقية الصغيرة المتبقية.
  7. احتضن أطباق بتري لمدة 15 دقيقة في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
  8. قم بإزالة المادة الطافية ، التي تحتوي على خلايا سلالة OL غير ملتصقة ، ونقلها إلى أنابيب سعة 50 مل (طافية من 2 طبق بتري لأنبوب 50 مل). تخلصي من أطباق بتري المطلية بالخلايا الدبقية الصغيرة.
  9. جهاز الطرد المركزي الطافي لمدة 5 دقائق عند 423 × جم. قم بإزالة المادة الطافية بعناية وأعد تعليق حبيبات الخلية ب 1 مل من وسط BS. قم بتجميع جميع الكريات في أنبوب مشترك سعة 50 مل واضبط الحجم على 10 مل مع وسيط BS.
  10. تحديد كثافة الخلية عن طريق عد الخلايا تحت المجهر.
    ملاحظه: يجب الحصول على كثافة خلية تتراوح بين 3 × 105 خلايا / مل و 5 × 105 خلايا / مل.
  11. أضف 20 مل من BS إذا كانت كثافة الخلايا أعلى من أو تساوي 4 × 105 خلايا / مل للحصول على حجم نهائي قدره 30 مل ، أو أضف 10 مل فقط من BS إذا كانت كثافة الخلايا أقل من 4 × 105 خلايا / مل للحصول على حجم نهائي قدره 20 مل.
  12. صفيحتين أو ثلاثة أطباق بتري مطلية مسبقا مقاس 100 مم مع 10 مل من تعليق الخلية. احتضن في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
  13. قم بإزالة الحطام من أطباق Petri عن طريق تحديث كل BS medium 2 ساعة لاحقا.
    ملاحظه: افحص المزرعة تحت المجهر قبل وبعد التطهير للتحقق من كثافة الخلايا وكفاءة إزالة الحطام.
  14. احتضان لمدة يومين في وسط BS في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
    ملاحظه: افحص الثقافة تحت المجهر. يجب أن يكون التقاء 70٪ إلى 80٪.
فئة

2. إنتاج OCM

ملاحظة: قم بتنفيذ هذه الخطوات في غطاء التدفق الصفحي في ظل ظروف معقمة.

  1. قم بإعداد NB-B27low medium وفقا للجدول 2.
  2. جدد وسط الاستزراع ب 10 مل من الوسط الدافئ NB-B27low. احتضان لمدة يومين في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
  3. احصد OCM ، أي المادة الطافية التي تحتوي على عوامل تفرز OL. قم بتعقيم OCM باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر.
    ملاحظه: قم بتخزين OCM في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة أقصاها شهرين.

الجدول 1: تحضير وسائط Bottenstein-Sato (BS).

وسائل الإعلام Bottenstein-Sato (BS) التركيز النهائي وسط النسر المعدل من Dulbecco البنسلين - ستربتومايسين 100 وحدة دولية / مل apo-Transferrin الإنسان 100 ميكروغرام / مل BSA (ألبومين مصل الأبقار) 100 ميكروغرام / مل إنسولين 5 ميكروغرام / مل PDGF 10 نانوغرام / مل البروجسترون 62 نانوغرام / مل بوتريسين ثنائي هيدروكلوريد 16 ميكروغرام / مل سيلينيت الصوديوم 40 نانوغرام / مل T3 (ملح الصوديوم 3،3 '، 5-Triiodo-L-thyronine) 30 نانوغرام / مل T4 (ل-هرمون الغدة الدرقية) 40 نانوغرام / مل < p class = "jove_content" > الجدول 2: تحضير وسائط NB-B27low و NB-B27.

NB-B27 الوسائط المنخفضة التركيز النهائي العصبي العصبي مكمل B27 0.5 ضعف ل-جلوتامين 0.5 ملي البنسلين - ستربتومايسين 100 وحدة دولية / مل NB-B27 الوسائط التركيز النهائي العصبي العصبي مكمل B27 1x ل-جلوتامين 0.5 ملي البنسلين - ستربتومايسين 100 وحدة دولية / مل

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Materials

List of materials used in this article Name Company Catalog Number Comments مكمل B27 ثيرموفيشر 17504044 D- (+) - محلول الجلوكوز سيغما جي 8769 وسط النسر المعدل من Dulbecco ثيرموفيشر 31966021 الإيثانول 100٪ سيغما 32221-م الإيثانول 70٪ كيماويات VWR 83801.36 مصل ربلة الساق الجنينية ثيرموفيشر 10082147 العصبي العصبي ثيرموفيشر 21103049 البنسلين - ستربتومايسين ثيرموفيشر 15140122 محلول ملحي مخزن بالفوسفات بدون كالسيوم ومغنيسيوم ثيرموفيشر A1285601 بولي إيثيلينيمين(PEI) سيغما ص 3143 وسائل الإعلام Bottenstein-Sato (BS) apo-Transferrin الإنسان سيغما تي 1147 BSA (ألبومين مصل الأبقار) سيغما أ 4161 وسط النسر المعدل من Dulbecco ثيرموفيشر 31966021 إنسولين سيغما ط5500 PDGF بيبروتك AF-100-13A البنسلين - ستربتومايسين ثيرموفيشر 15140122 البروجسترون سيغما ص 8783 بوتريسين ثنائي هيدروكلوريد سيغما ص 5780 سيلينيت الصوديوم سيغما الطراز S5261 T3 (ملح الصوديوم 3،3 '، 5-Triiodo-L-thyronine) سيغما تي 6397 T4 (ل-هرمون الغدة الدرقية) سيغما تي 1775 ادوات مرشح 0.22 ميكرومتر سارتوريوس 514-7010 1 مل حقنة تيرومو 1611127 طبق بتري 100 مم دوتشر 193100 أنبوب 15 مل كورنينج لعلوم الحياة 734-1867 أنبوب 50 مل كورنينج لعلوم الحياة 734-1869 طبق بتري 60 مم دوتشر 67003

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Oligodendrocyte Conditioned MediumOligodendrocyte Lineage CellsCell Attachment EnhancementNutrient Poor Medium IncubationMedium Filtration SterilizationBioactive Molecule SecretionOCM Storage PreservationPolymer Coated Petri DishHumidified Incubator ConditionsLaminar Flow Hood Sterility

Related Articles