تحضير أطباق الثقافة المجزأة المغلفة بالكولاجين لزراعة الخلايا العصبية

الملخص

المصدر: Zepecki, J. P., et al. المراقبة في الوقت الفعلي لهجرة خلايا الورم الدبقي البشري على الثقافات المشتركة للخلايا العقدية العقدية الجذرية الظهرية. J. Vis. Exp. (2019)

يوضح هذا الفيديو إنشاء نظام زراعة خلايا من ثلاث أقسام باستخدام الكولاجين والشحوم غير التفاعلية. يستخدم هذا النظام لمراقبة التفاعلات بين خلايا الورم الدبقي والمحاور في الوقت الفعلي.

البروتوكول

1. مزرعة مجزأة للعقد الجذرية الظهرية للفئران (DRGs) ، والخلايا قليلة التغصن (OPCs) ، و hGCs (خلايا الورم الدبقي البشري)

< p class = "jove_title" >1. تحضير أطباق الثقافة المجزأة

ملاحظة: قم بتنفيذ الخطوات التالية في الأيام التي تسبق الحصاد المخطط ل DRGs.

1. قم بتجميع أطباق الثقافة المجزأة.
2. يخفف محلول مخزون الكولاجين إلى 500 ميكروغرام / مل في H₂O المقطر المعقم ؛ تخلط جيدا.
3. باستخدام ماصة نقل معقمة، املأ طبق استزراع مقاس 35 مم ب 2 مل من محلول الكولاجين؛ قم بإزالة المحلول مع ترك طبقة رقيقة من الكولاجين وراءه، وضعها في الطبق التالي مقاس 35 مم. كرر هذه العملية ، مع إضافة المزيد من محلول الكولاجين حسب الحاجة ، حتى يتم تغليف جميع الأطباق.
4. بمجرد طلاء جميع الألواح ، ضع الألواح في صينية ثقافة مقاس 245 مم × 245 مم وضع ثلاث وسادات شاش مقاس 1 مم × 1 مم في وسط الدرج.
5. لبلمرة الكولاجين ، قم ببلل ضمادات الشاش ب 1 مل من هيدروكسيد الأمونيوم المركز وقم بتغطية الصواني لمدة 15 دقيقة.
6. قم بإزالة ضمادات الشاش واترك الأطباق مقاس 35 مم تجف في غطاء التدفق الرقائقي.
7. أثناء تجفيف الأطباق ، قم بتحميل برميل قضيب شحم الحقنة بشحم عالي التفريغ. ضع الغرف المجزأة في زجاجة وسائط كبيرة مملوءة بالماء المقطر. تعقيم كلاهما عن طريق التعقيم واتركه ليبرد.
8. قم بإخراج نقطة إبرة 18 جيجا لعمل طرف حاد. تعقيم في 70٪ إيثانول. نعلق الإبرة على حقنة الشحوم.
9. عقم أشعل النار عن طريق نقعها في 70٪ من الإيثانول ؛ اتركه يجف في الهواء في غطاء التدفق الرقائقي.
10. قم بإزالة الغطاء من طبق جاف ومغطى بالكولاجين مقاس 35 مم. امسك الطبق بين الإبهام وإصبع السبابة. أمسك أشعل النار باليد الأخرى. اضغط بقوة لإحداث خدوش بعرض 200 ميكرومتر عبر منتصف الطبق.
11. باستخدام ماصة المراعي ، ضع قطرتين من الوسط القاعدي العصبي المكمل في وسط الخدوش.
12. كرر الخطوات 1.1.10-1.1.11 حتى يتم خدش جميع الأطباق.
13. جفف الغرف المجزأة في غطاء تدفق رقائقي.
14. باستخدام ملقط مرقئ معقم ، أمسك غرفة واحدة مجزأة بواسطة المقسم المركزي. اقلب الملقط المرقئ بحيث يكون الجزء السفلي من الغرفة متجها لأعلى.
15. ضع شحم السيليكون على الغرفة المجزأة ، بدءا من الأعلى. تأكد من وضع الشحوم بشكل أنيق وتداخلها في جميع الزوايا.
16. قم بإزالة الغطاء من طبق 35 مم. اقلب الطبق وضع الخدوش فوق الغرفة. اضغط على الجزء السفلي من الطبق برفق باستخدام ملقط.
17. اقلب اللوحة برفق باستخدام ملقط مرقئ. حرر الملقط.
18. ضع كومة من الشحوم في قاعدة المقصورة المركزية. املأ كل غرفة بالوسط القاعدي العصبي المكمل (NB) وتحقق من وجود تسريبات. سد التسريبات بشحم السيليكون حسب الحاجة.
19. استمر في تجميع جميع أطباق الاستزراع وتخزينها طوال الليل عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات طبق ثقافة الخلية كورنينج 430165 35 مم × 10 مم إبرة تحت الجلد، 18 جرام دينار بحريني 511097 محلول هيدروكسيد الأمونيوم فيشر ساينتيك أ 669-500 تتركز طبق ثقافة الخلية كورنينج 430165 غرفة كامبينوت تايلر للأبحاث العربة 10 ملقط مرقئ روبوز RS-7035 كولتركس راتات كولاجين I تريفيجن 3440-100-01 دبوس أشعل النار تايلر للأبحاث معسكر العلاقات العامة الوسط العصبي القاعدي ثيرمو فيشر 21103049 شحم السيليكون ملف معدني علبه الشاش حاضنة CO2 ماصة زجاجية