تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
< p class = "jove_title" >
1. تحضير الحلول والمواد
- قم بإعداد محلول Ringer عن طريق خلط 123.3 ملي كلوريد الصوديوم ، و 1.53 ملي كلوريدالمكالسيوم 2 ، و 4.96 ملي كلوريد الرأس ، و 0.809 ملي مولار Na2HPO4 ، و 0.147 ملي مولار KH2PO4 (انظر جدول المواد). اضبط درجة الحموضة على 7.4 وقم بتعقيمها في زجاجات سعة 100 مل. يحفظ في مكان نظيف وجاف. لا تغسل الزجاجات بالصابون (تعامل مع الأواني الزجاجية لزراعة الأنسجة).
- قم بإعداد 1 مجم / مل من محلول المخزون من الفبرونيكتين (FN) (انظر جدول المواد) عن طريق إذابة FN في محلول Ringer المعقم وتخزينه في 100 ميكرولتر عند -80 درجة مئوية (مستقر لمدة 4 سنوات على الأقل).
- قم بإعداد وسائط استزراع كاملة عن طريق استكمال وسائط L15 بنسبة 0.8٪ L-glutamine و 0.08٪ بنسلين / ستربتومايسين و 10٪ FBS و 10٪ مستخلص جنين الكتاكيت. قم بإنشاء 3 مل من الحصص وتخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية
ملاحظه: إذا تم احتضان الثقافات في حاضنة ثاني أكسيد الكربون2 ، فيجب استبدال Dulbecco's Modified Eagle Medium F12 (DMEM / F12) ب L15 ، الذي يتم تخزينه للهواء.
- قم بإعداد إطارات دعم ورق الترشيح (مستطيلات من الورق بحجم 1 سم × 1.5 سم تقريبا مع فتحتين أو ثلاثة ثقوب مثقوبة متداخلة على المحور الطويل).
- قم بعمل ثقوب على طول حافة قطعة كبيرة من ورق الترشيح باستخدام ثقب قياسي ثلاثي الفتحات ، وقم بقص / قص الحافة المثقوبة إلى شريط ، ثم قم بقص الشريط بين الثقوب إلى مستطيلات بطول ~ 1.5 سم. ورق ترشيح الأوتوكلاف قبل الاستخدام (اختياري).
- اجمع أدوات التشريح ، بما في ذلك الملقط الدقيق (# 1) ، والملقط الحاد ، ومقص التشريح ، والمقص الزنبركي ، وإبر التنغستن الحادة.
< p class = "jove_title" >
2. تحضير أطباق الثقافة
- حدد أطباق ثقافة الطية العصبية (انظر جدول المواد) المناسبة للتطبيق النهائي.
- بالنسبة للثقافات التي سيتم تثبيتها وتلطيخها ، استخدم أغطية زجاجية موضوعة في أطباق زراعة الأنسجة متعددة الآبار.
ملاحظه: ستتحرك الأغطية التي تتناسب مع حجم البئر بشكل أقل مع خلط السوائل ، مما يجعل النباتات أقل عرضة للتحول وأكثر عرضة للالتصاق بالغطاء بدلا من قاع الطبق.
حدد حجرة - واحدة ذات قاع زجاجي أو أطباق حجرة مقسمة (انظر جدول المواد) للتصوير المباشر باستخدام المجهر المقلوب.
- للتصوير المباشر على مجهر مستقيم أو مجهر استريو ، استخدم لوحات زراعة الأنسجة ذات 6 أو 12 أو 24 بئرا مناسبة بصريا.
- حدد أطباق زراعة الأنسجة البلاستيكية للجمع الجماعي لخلايا القمة العصبية المهاجرة لتحليلات الإنتاجية العالية.
- أضف 10 وحدة / مل من البنسلين و 10 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين إلى زجاجة 100 مل من محلول رينجر المعقم (على سبيل المثال ، 100 ميكرولتر من 10,000 وحدة / مل بنسلين و 10,000 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين ، لصنع P / S من رينجر). استخدم Ringer's P / S في غضون 1 أسبوع.
- قم بإذابة كمية 1 مجم / مل من FN على الجليد. خفف باستخدام P / S من Ringer إلى تركيز 10-100 ميكروغرام / مل من FN.
- PIPET ما يكفي من محلول FN لتغطية قاع البئر أو الطبق. على سبيل المثال ، 100 ميكرولتر لكل بئر في طبق 24 بئرا ، 500 ميكرولتر لطبق 35 مم.
- استبدل الغطاء واحتضان الأطباق أو الأطباق بمحلول FN في حاضنة رطبة (أو صينية مغطاة بمناشف ورقية مبللة بالماء المقطر) عند 38 درجة مئوية (100 درجة فهرنهايت) لمدة ساعة واحدة على الأقل أثناء تشريح الطيات العصبية.
< p class = "jove_title" >
3. تشريح الطيات العصبية
- انقل الجنين إلى طبق نظيف يحتوي على محلول Ringer's P / S واشطف الجنين عن طريق إمساك إطار ورق الترشيح بالملقط والمضمضة برفق ذهابا وإيابا لإزالة أي صفار يحجب رؤية الجنين. استبدل P / S الخاص ب Ringer أو انقله إلى طبق طازج إذا أصبح غائما.
- ضع جانب الجنين الظهري / الإطار لأعلى تحت مجهر تشريح. ترك الجنين على الإطار الورقي لإبقائه مشدودا ومثبتا في مكانه ، قم بإزالة غشاء vitelline باستخدام ملقط لفضح الطيات العصبية.
ملاحظه: إذا سقط الجنين من إطار الورق ، فيمكن وضعه بشكل مسطح في الطبق أو تثبيته في طبق مطلي ب sylgard للتشريح.
- باستخدام مقص زنبركي أو إبرة تنجستن حادة ، قم باستئصال الطيات العصبية في الدماغ الأوسط بعناية. قم بتضمين ذيلية الأنسجة إلى الحويصلات البصرية المتوسعة والمنقارية إلى الدماغ الخلفي ، حيث بدأت انقباضات المعين للتو في الظهور (الهلال القلبي هو أيضا مؤشر مفيد ، الشكل 1 ب ، ج). احرص على استئصال الجانب الظهري الأكبر من الطية العصبية مع الحد الأدنى من الأنبوب العصبي الملوث والأديم الظاهر غير العصبي (الشكل 1 ج).
- انقل الطيات العصبية إلى طبق نظيف يحتوي على Ringer's P / S باستخدام ماصة P20 أو ماصة باستور زجاجية معقمة مغسولة بصفار Ringer's P / S (هذا يمنع البلاستيك أو الزجاج لمنع الأنسجة من الالتصاق). قم بتخزين الطيات المجمعة على الجليد أثناء تشريح الطيات الإضافية.
< p class = "jove_title" >
4. طيات الطلاء العصبية
- قم بإذابة كمية من وسائط الثقافة الكاملة (القسم 1 ، الخطوة 3). أضف 100 وحدة / مل من البنسلين و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين وتعقيم الفلتر. احتفظ بالوسائط المعدة عند 37-38 درجة مئوية أثناء تنفيذ خطوات أخرى.
- قم بإزالة أطباق الثقافة من الحاضنة (القسم 2 ، الخطوة 5). باستخدام ماصة أو ماصة باستور، قم بإزالة محلول FN من أغطية الغطاء أو الأطباق أو الآبار. بعد شطف الركيزة المطلية ب FN باستخدام Ringer's P / S ، أضف حجما مناسبا من وسائط الثقافة الكاملة إلى الأطباق أو الآبار (500 ميكرولتر للآبار في صفيحة 24 بئرا ، 2 مل لطبق 35 مم أو طبق من ستة آبار).
ملاحظه: يمكن أن تحافظ الأحجام الأصغر على الكواشف باهظة الثمن (على سبيل المثال ، منخفضة تصل إلى 200 ميكرولتر للوحة 24 بئرا) ولكن تأكد من ترطيب الطبق بدرجة كافية لتجنب التبخر.
- باستخدام ماصة p20 أو p200، اشطف طرف الماصة أولا باستخدام Ringer's P/S Pixely لمنع البلاستيك ومنع الأنسجة من الالتصاق. بعد ذلك ، انقل الطيات العصبية المعزولة إلى أغطية FN المطلية ، مع الحرص على نقل أقل قدر ممكن من P / S ل Ringer. ضع الطية (الطيات) باتجاه مركز الغطاء المطلي بالجبهة الوطنية.
ملاحظه: يمكن طلاء طيات عصبية واحدة أو بضع طيات عصبية على غطاء 12 مم في بئر 19 مم ، حتى 50 على لوحة 35 مم.
- بعد السماح للنباتات بالاستقرار لمدة 10-15 دقيقة ، ضعها في غرفة رطبة عند 38 درجة مئوية (100 درجة فهرنهايت) عن طريق حمل أطباق الثقافة ببطء وبعناية مع طيات عصبية مطلية. سيؤدي ذلك إلى تقليل تحول الطيات العصبية في الآبار ، مما يضمن بقائها مشتتة وتلتصق بأي أغطية.
ملاحظه: عند استخدام L15 (وليس DMEM) ، يمكن أيضا تحضين أطباق ثقافة النبتة في حاضنة البيض باستخدام صينية مغطاة بمنشفة ورقية مبللة.
- احتضان مزارع الطيات العصبية في الحاضنة المرطبة طوال مدة الهجرة النشطة (حوالي 16-20 ساعة إجمالا ، الشكل 2).
