عزل الخلايا العصبية العقدية الدهليزية من الأذن الداخلية للفأر

الملخص

المصدر: Iyer ، M. R. et al. ، عزل واستزراع العقدة الدهليزية والحلزونية سوماتا من القوارض حديثي الولادة لتسجيلات المشبك.J. Vis. Exp. (2023).

يعرض هذا الفيديو طريقة لعزل الخلايا العصبية الدهليزية من الأذن الداخلية لجرو الفأر. يحدد بدقة الخطوات المتبعة في تشريح الأذن الداخلية ، وحصاد العقدة الدهليزية ، وبالتالي فصل العقدة إلى خلايا مفردة. ثم يتم زراعة هذه الخلايا على أطباق ذات قاع زجاجي لإنشاء ثقافة الخلايا العصبية الدهليزية.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

< p class = "jove_title" >1. الاستعدادات

ملاحظة: يمكن إعداد الحلول والأدوات الموضحة في هذا القسم في وقت مبكر واستخدامها في يوم التشريح والتسجيل.

1. تحضير وسائط Liebovitz مع 10 ملي مولار HEPES (محلول L-15). تصف الخطوات التالية صنع 1 لتر من محلول L-15.
   1. صب 990 مل من H₂O منزوع الأيونات في دورق واحد. قم بقياس وإضافة 2.386 جم (10 ملم) من HEPES. أضف زجاجة واحدة من 1 لتر من مسحوق محلول L-15.
      ملاحظة: يتميز مسحوق L-15 بعمر افتراضي أطول ويشغل مساحة تخزين أقل. بدلا من ذلك ، قم بشراء محلول L-15 ومكملات مع HEPES. يحتوي الخيار الأخير أيضا على خيار استخدام محلول خال من الفينول ، وهو أمر مفيد للتصوير الفلوري.
   2. حرك المحلول على طبق تحريك. باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني ، أضف ببطء 1 نيوتن هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) للحصول على درجة حموضة بين 7.34 و 7.36.
   3. أضف H₂O منزوع الأيونات حتى يصل المحلول إلى حجم 1,000 مل. قم بتصفية المحلول باستخدام غشاء بحجم المسام 0.22 ميكرومتر.
      ملاحظه: يمكن تخزين محلول L-15 عند 4 درجات مئوية لمدة 1-2 أسابيع. في حالة استخدام L-15 المصنوع من الفينول الأحمر ، فسوف يتحول المحلول إلى اللون الوردي إذا كان أساسيا جدا (الرقم الهيدروجيني > 7.4) أو البرتقالي إذا كان حمضيا جدا (الرقم الهيدروجيني < 7.34).
2. تحضير وسط الاستزراع للخلايا العصبية العقدية الدهليزية (VGNs). اتبع الخطوات أدناه لعمل 50 مل من وسط الاستزراع:
   1. أضف 47.5 مل من الحد الأدنى من الوسط الأساسي GluMAX-I إلى دورق زجاجي نظيف.
   2. قم بقياس وإضافة 0.1194 جم (10 ملم) من HEPES. يقاوم هذا المخزن المؤقت الإضافي تغيرات الأس الهيدروجيني بينما تستقر الخلايا قبل نقلها إلى الحاضنة.
   3. أضف 2.5 مل من مصل الأبقار الجنينية (FBS). هذا يجعل 5٪ من حيث حجم FBS في حجم إجمالي يبلغ 50 مل من المتوسط.
   4. حرك المحلول على طبق تحريك. باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني ، أضف ببطء 1 N هيدروكسيد الصوديوم للحصول على درجة حموضة بين 7.38 و 7.4.
   5. أضف 0.5 مل من البنسلين والستربتومايسين. قم بتصفية المحلول من خلال مرشح معقم 0.22 ميكرومتر. قم بتخزين المحلول في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
   6. قبل الاستخدام ب 30 دقيقة على الأقل ، انقل وسائط المزرعة إلى قارورة زراعة الأنسجة بغطاء مفتح. ضع القارورة مع وسائط الاستزراع في حاضنة بتركيز 5٪ CO₂ عند 37 درجة مئوية.

< p class = "jove_title" >2. تصنيع ماصات التريتوريشن

ملاحظة: يمكن إعادة استخدام ماصات التصريف في تجارب متعددة. اغسل الماصات بالإيثانول والماء ومحلول L-15 قبل كل استخدام ونظفها بالماء والإيثانول بعد كل استخدام. تخزينها بعناية بين الاستخدامات.

1. لتحضير ماصات التخلي لتفكك الخلايا، أمسك ماصة باستور زجاجية على لهب موقد بنسن. بمجرد أن يبدأ الطرف الزجاجي في الذوبان ، قم بتمديد الزجاج إلى قطر الطرف المطلوب. اسحب أحد طرفي الماصة بعيدا عن اللهب لإنشاء انحناء صغير.
2. اجعل الماصة المنحنية بالقرب من المجهر. باستخدام بلاط التسجيل ، قم بتسجيل وكسر الزجاج بالقطر المطلوب.
3. مرر طرف الماصة فوق الجزء العلوي من لهب الموقد بنسن. سيؤدي ذلك إلى تلميع الحواف الخشنة بالقرب من الحافة. تحقق للتأكد من أن الطرف غير مغلق باللهب.
4. كرر العملية حتى يتم تحضير أربع أو خمس ماصات بأحجام مختلفة.

< p class = "jove_title" >3. استخراج العقدة الدهليزية وطلاء الخلايا العصبية الدهليزية

1. التحضير للتشريح
   1. تحضير خليط إنزيمي من محلول L-15 مع 0.05٪ كولاجيناز و 0.25٪ تربسين. على سبيل المثال ، أضف 0.001 جم من الكولاجيناز و 0.005 جم من التربسين إلى 2 مل من محلول L-15 في دورق ، أضف أداة تقليب مغناطيسية صغيرة ، وحرك حتى تمتزج تماما. توضع جانبا في درجة حرارة الغرفة.
   2. قم بإعداد المقصلة التي تم الحصول عليها تجاريا عن طريق وضع مناشف ورقية على الجانب وتحت المقصلة لتقليل تعرض سطح الطاولة والأسطح الأخرى للدم والمواد البيولوجية الأخرى.
   3. ضع مقصا كبيرا من الفولاذ المقاوم للصدأ ، ملقطا كبيرا ، ومقص زنبركي كبير. احتفظ بزجاجة رذاذ كبيرة تحتوي على 70٪ إيثانول في متناول يدك لتنظيف الرأس.
   4. املأ دورق سعة 100 مل بمحلول L-15 وضعه على الثلج. أكسجة محلول L-15.
   5. ضع مقص الزنبرك والمقص الجراحي والملقط والمشرط وماصة النقل (انظر جدول المواد).
   6. قم بإعداد طبق بتري مقاس 60 مم (للتشريح الإجمالي) وطبقين بتري مقاس 35 مم (للتنظيف / التشريح الدقيق للعقد). املأ الطبق مقاس 60 مم بمحلول L-15 المؤكسج باستخدام حقنة سعة 30 مل بطرف مرشح 0.22 ميكرومتر.
2. القتل الرحيم وتنظيف الرأس والاستئصال النصفي
   1. قم بوزن الجراء لحساب الجرعة المناسبة من التخفيف القاتل بالإضافة إلى التخفيف لإدارته داخل الصفاق (~ 0.01 مل لكل 10 جم).
   2. بمجرد الوصول إلى مستوى عميق من التخدير ، كما تم تقييمه من خلال عدم الاستجابة لقرص إصبع القدم ، قم بقطع الرأس باستخدام المقصلة.
   3. اشطف الرأس جيدا بمحلول 70٪ ثم جيدا بمحلول L-15.
   4. إزالة الجلد تماما من الجمجمة. قم بتقسيم الرأس باستخدام مقص زنبركي كبير عن طريق البدء من نقطة دخول الحبل الشوكي إلى الدماغ وإجراء قطعتين ، الأول يقطع الجزء العلوي من الجمجمة والثاني من خلال أسفل الفك. الانتهاء من تقسيم الرأس باستخدام مقص جراحي.
   5. ضع نصفي جانب الرأس والدماغ لأسفل في طبق بتري مقاس 60 مم مملوء بمحلول L-15. ضع الأنسجة الطازجة التي لم يتم تشريحها حاليا على الثلج.
3. استخراج العقدة الدهليزية العلوية
   1. استخرج الدماغ باستخدام مقص جراحي مغلق. قطع وإزالة العصب القحفي لفصل الدماغ تماما عن الجمجمة.
      ملاحظه: في هذه المرحلة ، يجب أن تكون الكبسولة الأذنية (على شكل الرقم 8) مرئية في الجزء الخلفي من الرأس.
   2. باستخدام الملقط والبدء من مؤخرة الرأس ، اسحب المواد الغشائية الشفافة.
   3. اقطع الجزء العلوي من الجمجمة باستخدام مقص جراحي. قم بإزالة الأنسجة الزائدة من مؤخرة الرأس والرقبة لجعل منطقة التشريح وكبسولة الأذن أكثر نظافة وأسهل في الوصول إليها.
      ملاحظه: تجنب جعل الطبق غائما جدا عن طريق التخلص من الأنسجة الزائدة طوال العملية.
   4. انقل الأنسجة إلى طبق بتري ثان بمحلول L-15 الطازج. حدد موقع الكبسولة الأذنية والأعصاب السمعية والدهليزية العلوية والأعصاب الدهليزية السفلية. اقطع العصب السمعي وافصل العقد العلوية والسفلية باستخدام مقص زنبركي صغير.
      ملاحظه: على الرغم من أن سوماتا العصب الدهليزي توجد في كل من العقد السفلية (الأرق) والعلوية (السميكة) ، إلا أن الخلايا المستخرجة من العقدة العلوية تتمتع ببقاء أفضل.
   5. باستخدام مشرط ، احلق الحافة العظمية برفق لإضعاف المنطقة العظمية التي يغوص تحتها العصب في الكبسولة العظمية. قم بإزالة الحطام بعناية باستخدام ملقط ناعم ، مما يكشف الجزء المتورم بالكامل من العقدة.
   6. استخدم مقص الزنبرك الناعم لقطع وفصل العقدة عن فرع العصب المحيطي الذي يغوص باتجاه الرحم.
   7. قم بإزالة العقدة العلوية باستخدام ملقط دقيق ، مع التأكد من عدم الضغط بالقرب من الأنسجة العقدية. انقله إلى طبق بتري مقاس 35 مم مع محلول L-15 الطازج.
   8. قبل المتابعة ، قم بتسخين محلول الإنزيم مسبقا: صب خليط الإنزيم في طبق بتري 35 مم وضعه في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة.
   9. نظف العقدة باستخدام ملقط دقيق ومقص زنبركي صغير عن طريق إزالة العظام (التي تبدو بيضاء ومتبلورة في الهيكل) والأنسجة الزائدة والألياف العصبية وأي هياكل أخرى لا لزوم لها. احرص على تقليل إزالة أي أنسجة عقدية.
4. تفكك الأنسجة والطلاء
   1. انقل العقد التي تم تنظيفها إلى محلول الإنزيم المسخن مسبقا وضعها مرة أخرى في الحاضنة لمدة 10 إلى 40 دقيقة. سيؤدي الإفراط في معالجة الأنسجة بالإنزيمات إلى الذوبان الكامل للعقد قبل التجربة.
      ملاحظة: يعتمد مقدار الوقت الذي تخضع فيه الأنسجة للعلاج الأنزيمي على عمر. على سبيل المثال ، يتم التعامل مع العقد من الفئران P9 بالإنزيم لمدة 25 دقيقة ، ويتم معالجة العقد من فئران P15 بالإنزيم لمدة 35 دقيقة.
   2. انقل العقد إلى طبق بتري مقاس 35 مم بمحلول L-15 الطازج واحتضنه لمدة 2-3 دقائق.
   3. انقل العقد إلى طبق بتري آخر مقاس 35 مم مليء بوسائط الاستزراع المفلترة.
   4. باستخدام ماصة دقيقة سعة 200 ميكرولتر، ضع الماصة قطرة ~150 ميكرولتر من وسائط الاستزراع المفلترة على طبق مطلي بقاع زجاجي. لا تضيف الكثير من المحلول ، حيث من المهم الحفاظ على التوتر السطحي لتشكيل فقاعة من المحلول تبقى فوق الغطاء الزجاجي.
   5. انقل العدد المطلوب من العقد (واحد إلى أربعة) إلى الغطاء.
   6. اسحب كمية صغيرة من وسط الاستزراع من طبق الاستزراع لشطف ماصة التخلي بوسط لمنع الأنسجة من الالتصاق بجوانب الماصة الزجاجية. قم بإخراج الأنسجة برفق وبشكل متكرر عبر الماصة حتى يتم فصل العقد بشكل كاف.
      ملاحظه: لا تفرط في إرهاق الأنسجة لمحاولة تعليق خلية واحدة أو السماح للخلايا بالانهيار في قاع الطبق باستخدام الضغط الإيجابي المفرط. تجنب أيضا تكوين فقاعات الهواء ، لأن ذلك سيقلل من بقاء الخلايا. التخلي اللطيف هو المفتاح لتحقيق بقاء ناجح للخلية.
   7. دع الخلايا ترتاح لمدة 5 دقائق. تحقق تحت المجهر الضوئي لمعرفة ما إذا كانت الخلايا قد استقرت على الغطاء.
   8. ضع طبق ثقافة بحذر في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 12-24 ساعة. مرة أخرى ، تأكد من الحفاظ على فقاعة المحلول سليمة.
      ملاحظه: عند الزراعة لمدة تزيد عن 24 ساعة ، قم بتحديث وسائط الثقافة يوميا. يمكن أن تكون هذه نقطة توقف محتملة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مكمل B27 (50x) ، خال من المصل ثيرمو فيشر العلمي 17504044 مادة مضافة إلى وسط الثقافة ، ل SGN أكواب (1000 ، 100 ، 10) مليلتر جهاز طرد مركزي أعلى مقاعد البدلاء الولايات المتحدة الأمريكية العلمية هاتف: 2641-0016 موقد بنسن كولاجيناز سيجما ألدريتش ج 5318 واحد من كل ثلاثة إنزيمات لهضم الأنسجة غطاء زجاجي ، مستطيل ، # 1 سمك ، 22x40 وارنر إنسترومنتس 64-0707 DMSO البيوتيوم 90082 Dnase I ، من البنكرياس البقري سيجما ألدريتش 11284932001 واحد من كل ثلاثة إنزيمات لهضم الأنسجة ملقط دومون # 3 (حاد) أدوات العلوم الدقيقة 11231-30 ملقط دومون # 5 (ناعم) أدوات العلوم الدقيقة 11251-10 دومون # 55 ملقط (ناعم) أدوات العلوم الدقيقة 11255-20 ايثانول مختبرات ديكون 2716 لتنظيف الرأس وحول مقعد التشريح الشعيرات الدموية البورسليكات الخيطية للأقطاب الكهربائية أدوات سوتر BF140-117-10 شفرة تشريح ذات حواف دقيقة أدوات العلوم الدقيقة 10010-00 ماصات باستور زجاجية VWR 14673-010 لسحب ماصات التخلي مصل الأبقار الجنينية المعطل بالحرارة ثيرمو فيشر العلمي 16140063 مادة مضافة إلى وسط الثقافة هيبس سيجما ألدريتش H3375-100G للتخزين المؤقت للأس الهيدروجيني جميع المحاليل في البروتوكول لوح تسخين / أدوات التقليب المغناطيسية VWR 76549-914 دلو معزول مملوء بالثلج للحفاظ على برودة جميع العينات والحلول مقص زنبركي كبير أدوات العلوم الدقيقة 14133-13 ليبوفيتز وسط سيجما ألدريتش L4386 محاليل التشريح والحمام غرفة تسجيل حمام منخفضة المستوى لأطباق الثقافة وارنر إنسترومنتس 64-0236 محاقن Luer-Lok ، 30 مل دينار بحريني 302832 لرسم محلول L-15 / HEPES / HEPES. مكمل MEM + Glutamax فيشر ساينتيك 41-090-101 قاعدة وسط الثقافة إبرة microFil لملء الماصات الدقيقة - مقياس 34 أدوات الدقة العالمية MF34G ملحق N2 (100x) ثيرمو فيشر العلمي 17502-048 مادة مضافة إلى وسيط الثقافة ، ل SGN هيدروكسيد الصوديوم (1 م) توماس العلمية 319511-500 مل لدرجة الحموضة بالتحليل الحجمي الأكسجين ، الصف الطبي ، مع منظم وأنابيب كافية إدارة المواد USC MEDOX200 (رقم المعرف: 00015) للذوبان في محاليل التشريح والحمام بارافيلم بيميس PM992 لمبة ماصة باستور (3 مل) فيشر ساينتيك 03-448-25 لمبة ماصات التخلي البنسلين / الستربتومايسين ثيرمو فيشر العلمي 15140122 مادة مضافة لمنع تلوث وسط الاستزراع محلول القتل الرحيم القائم على البنتوباربيتال (على سبيل المثال ، Fatal Plus. 50 - 60 مجم / كجم جرعات) MWI صحة 15199 للقتل الرحيم مرشحات غشاء PES ، 0.2 ميكرومتر نالجين 566-0020 لحلول التصفية مرشحات حقنة معقمة غشاء PES ، 0.22 ميكرومتر ، 30 مم سيلتريت 229747 لتصفية المحاليل المسحوبة في المحاقن أطباق بتري ، 35 × 10 مم جينيسي العلمية 32-103 للتشريح الدقيق وتثبيت محلول تراجع الطرف في تكوين التصحيح المثقوب أطباق بتري، 60 × 15 مم ميدلاند العلمية ص 7455 للتشريح الإجمالي مقياس الأس الهيدروجيني ميتلر توليدو الموديل S20 الماصات (1000 ، 200 ، 10) ميكرولتر الولايات المتحدة الأمريكية العلمية بولي دي ليسين مطلي بالزجاج المطلي طبق ثقافة ماتيك P35GC-0-10-C إلى لوحة الخلايا العصبية للثقافة منصة تغيير سريع ، قاعدة ساخنة ، لأطباق الثقافة 35 مم وارنر إنسترومنتس 64-0375 الخلية المرجعية أدوات الدقة العالمية RC1T شفرة مشرط ميلتكس 4-315 مقبض مشرط أدوات العلوم الدقيقة 10003-12 المقياس العلمي ميتلر توليدو XS64 الماصات المصلية (10 ، 25) مليلتر فيشر ساينتيك طقم شحوم سيليكون (لختم الغطاء الزجاجي والغرفة) وارنر إنسترومنتس 64-0378 مقصلة الصغيرة كينت العلمية DCAP مقصلة الصغيرة كينت العلمية DCAP لقطع الرأس في حالة تشريح الفئران التي يزيد عمرها عن P15. مجهر تشريح ستيريو زييس ستيمي 2000 مقص جراحي مستقيم أدوات العلوم الدقيقة 14060-09 حقنة (3 ، 10 ، 30) مليلتر التربسين سيجما ألدريتش تي 1426 واحد من كل ثلاثة إنزيمات لهضم الأنسجة حقنة السل كوفيديان 8881500105 لتقديم محلول القتل الرحيم عن طريق الحقن داخل الصفاق مقص زنبركي من فاناس ، حافة القطع 2.5 مم أدوات العلوم الدقيقة 15000-08 قارورة حجمية ، 1000 ملليلتر دوار VWR 945300 ماء ، معقم u ltrapure ، R>18.18 ميغا أوم سم (على سبيل المثال ، تمت ترشيحه بواسطة نظام تنقية المياه Millipore-Sigma) ميليبور سيجما CDUFBI001