مقالة منهجية

عزل واستزراع الخلايا السليفة قليلة التغصن من قشرة دماغ جرو الفأر

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Sinyuk, M., et al. تشريح وعزل الخلايا الدبقية الفئرانية من مناطق الجهاز العصبي المركزي المتعددة. J. Vis. Exp. (2020)

يوضح هذا الفيديو تقنية لعزل واستزراع الخلايا السليفة قليلة التغصن (OPCs) من قشرة دماغ جرو الفأر.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

فئة

1. تفكك الأنسجة

ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الإجراءات التالية في خزانة سلامة حيوية مخصصة لزراعة الأنسجة المعقمة باستخدام تقنية معقمة ومواد معقمة.

  1. أضف 1 مل من 0.05٪ تريبسين يحتوي على 0.53 ملي EDTA إلى كل أنبوب مخروطي سعة 15 مل سعة 9 مل من DMEM والأنسجة لبدء تحلل الأنسجة.
    ملاحظه: يحتوي DMEM على كمية عالية من كلوريد الكالسيوم ، والذي يمكن أن يعمل كمثبط للتربسين. إذا لم يكتمل التفكك باتباع الخطوات الموضحة ، فيمكن استخدام محلول الملح المتوازن من هانكس بدون الكالسيوم أو المغنيسيوم. بعد التربسين ، يمكن تحييد الإنزيم عن طريق إضافة مثبط التربسين ، على الرغم من أنه يجب إضافة الكالسيوم مرة أخرى إلى المحلول لأنه عامل مساعد ل DNase I ، والذي يستخدم في الخطوات اللاحقة.
  2. قم بترتيبات ماصة سعة 10 مل بمعدل 20 ضعفا تقريبا.
  3. انقل معلقات الخلية إلى أنابيب مخروطية فارغة سعة 50 مل.
  4. احتضان المحلول عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 15 دقيقة ، مع تحريك المحللات برفق بعد 8 دقائق.
  5. أضف 5 مل من MGM و 200 ميكرولتر (5 مجم / مل) DNase I إلى كل أنبوب للحصول على تركيز نهائي قدره 50 ميكروغرام / مل.
  6. قم بترقيم كل محللة بماصة سعة 10 مل 10x.
  7. دع معلقات الخلية تجلس لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة للسماح للأنسجة غير المنفصلة بالاستقرار في قاع الأنابيب.
  8. انقل معلقات الخلية إلى أنابيب مخروطية جديدة سعة 50 مل ، تاركة وراءها الأنسجة غير المنفصلة.
    ملاحظه: تحد خطوات التحلل والخلية الموضحة أعلاه بشكل كبير من كمية الأنسجة غير المنفصلة.
  9. الطرد المركزي الأنابيب عند 300 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية بدون فرامل.
  10. استنشق المادة الطافية وأعد تعليق كريات الخلية المتبقية في 5 مل من MGM.
  11. قم بترتيورث الحبيبات بماصة 5 مل 20x.
  12. ضع تعليق الخلية سعة 5 مل على قوارير T25 المطلية.
  13. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 وقم بتغيير الوسائط في البداية بعد 24 ساعة لإزالة بقايا الخلية.
    ملاحظه: توصي بعض البروتوكولات بتغيير أولي للوسائط بعد 72 ساعة. قد تكون هناك حاجة إلى تحسين هذه الخطوة.
  14. قم بإجراء تغيير الوسائط بنسبة 100٪ باستخدام MGM كل 48-72 ساعة حتى تتلاقى الخلايا بنسبة 80٪ (حوالي 5-7 أيام).
    ملاحظة: يجب تسخين جميع الوسائط إلى 37 درجة مئوية قبل تغيير الوسائط.
< p class = "jove_title" >2. عزل الخلايا السليفة قليلة التغصن

< ص الفئة = "jove_content">عند طلاء OPCs بعد العزل الأولي ، يجب أن تكون مطلية على سطح مطلي ب poly-D-lysine (لوحة معقمة أو غطاء). قم بإعداد هذه المواد قبل إكمال هذا القسم.

  1. بعد 15 ساعة من الرج ، قم بإزالة المادة الطافية من القوارير وطبقها على طبق بتري معقم مقاس 100 مم.
  2. احتضان المادة الطافية عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 30 دقيقة ، مع الدوران بعد 15 دقيقة لإزالة الخلايا الدبقية الصغيرة المتبقية ، حيث ستلتصق بسرعة كبيرة بالطبق. يمكن استخدام أطباق بتري غير المعالجة بزراعة الأنسجة لهذه الخطوة.
  3. قم بإزالة المادة الطافية غير الملتصقة للخلايا والعد واللوحة على سطح مطلي ب poly-D-lysine. عادة, 7,500-10,000 OPCs مطلية / سم2.
  4. احتضان عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة ساعة واحدة على الأقل (حتى 6 ساعات) ، ثم استنشق 95٪ من الوسائط برفق ، وأضف ببطء وسائط OPC الدافئة ، وسحب الوسائط على جدار البئر لتقليل اضطراب OPCs. قم بتغيير الوسائط كل 48 ساعة حتى تصبح الخلايا جاهزة للاستخدام.
    ملاحظة: من الأهمية بمكان تغيير بئر واحد فقط في كل مرة. OPCs حساسة ولا تتسامح بشكل خاص مع الظروف الجافة. تؤدي إضافة PDGF-AA في وسائط OPC إلى تأخير نضوج OPC إلى الخلايا قليلة التغصن. يمكن استبعاد هذا العامل من وسائط الاستزراع إذا كان التركيز التجريبي هو الخلايا قليلة التغصن الناضجة.

الجدول 1: وصفات المخزن المؤقت والوسائط.

< p class = "jove_content" > وسائط الدبقية المختلطة (MGM)

88 مل 1X DMEM (ارتفاع الجلوكوز ، مع L - الجلوتامين ، مع البيروفات الصوديومية) 10 مل FBS معطل بالحرارة 1.0 مل ل-جلوتامين (100X) 1.0 مل مضاد حيوي / مضاد للفطريات فئة

OPC Media (50 مل)

49 مل الوسائط العصبية القاعدية 1.0 مل مكمل B27 (50X) 10 نانوغرام / مل PDGF-AA ملاحظة: تتم إضافة PDGF-AA طازجا قبل كل تغيير في الوسائط.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 0.05٪ تريبسين و 0.53 ملي EDTA جيبكو 25300054 تفكك الأنسجة 1X PBS الرقم الهيدروجيني 7.4 جيبكو 10010031 الكاشف القياسي 50 مل ، قارورة زراعة الخلايا المربعة 25 سم غرينر بيو ون 690 175 قارورة زراعة الخلايا (T25) مضاد حيوي مضاد للفطريات 100X جيبكو هاتف: 15240-096 مكون الوسائط ملحق B-27 50X جيبكو 17504-044 مكون الوسائط ألبومين مصل الأبقار سيغما أ 9647-50 جي مخفف الأجسام المضادة DMEM (1X) ، ارتفاع الجلوكوز مع Na pyruvate جيبكو 11995040 مكون الوسائط دناسي الأول سيغما 10104159001 تفكك الأنسجة تعطيل حرارة مصل الأبقار الجنيني جيبكو A3840001 مكون الوسائط محلول الملح المتوازن من هانكس (بدون كالسيوم أو المغنيم) ثيرموفيشر 14170120 تفكك الأنسجة L-جلوتامين ، 200 ملم جيبكو 20530081 مكون الوسائط العصبي العصبي جيبكو هاتف: 21103-049 مكون الوسائط مصل الماعز العادي سيغما جي 9023 مكون حل الحجب بولي دي ليسين 12 مم # 1 غطاء زجاجي ألماني كورنينج بيوكوت 354086 ملتصق الخلية

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Poly D Lysine

مقالات ذات صلة