تقنية لتوليد عضيات الدماغ من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Boisvert، E. M. ، et al. طريقة ثابتة ذاتية التوجيه لتوليد عضيات الدماغ من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية. J. Vis. إكسب (2020).

< p class = "jove_content" >يوضح هذا الفيديو تقنية لتوليد العضيات الدماغية من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs). تتم معالجة الثقافة الملتصقة لمستعمرات hESC بالإنزيمات لفصلها وتقسيمها إلى مجموعات. تشكل هذه المجموعات مجالات ثلاثية الأبعاد في حالة تعليق ، والتي يتم تحفيزها بعد ذلك على التمايز إلى عضيات تحاكي قشرة الدماغ بطبقات من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. صيانة الخلايا الجذعية

1. حافظ على H9 hESCs على طبقة من مصفوفة الغشاء القاعدي المخفضة لعامل النمو (انظر جدول المواد ، يشار إليها ببساطة باسم المصفوفة) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
   1. لتغليف طبق واحد مكون من 6 آبار أو طبق واحد بحجم 10 سم ، امزج 100 ميكرولتر من المصفوفة مع 5.9 مل من وسائط النسر المعدلة (DMEM) / F12 من Dulbecco المثلجة. لف الأطباق في غشاء البارافين واحفظها طوال الليل عند 4 درجات مئوية. استخدمها في اليوم التالي لتمرير الخلايا بعد شفط المصفوفة / الوسائط الزائدة.
2. استزراع الخلايا من أسبوع لآخر بنسبة انقسام 1:12 تقريبا كل 7 أيام. حافظ على الخلايا باستخدام وسائط mTESR-1 في حاضنة منخفضة الأكسجين 37 درجة مئوية (5٪ O₂ ، 5٪ CO₂). قم بتحديث الوسائط يوميا. تخلص من الخلايا المميزة عن الثقافة بين الممرات باستخدام أدوات زجاجية.
3. يجب تمرير خلايا H9 قبل أربعة إلى ستة أيام من استخدامها لإنتاج العضيات. يجب تمرير الخلايا بنسبة 1: 8 تقريبا من مجموعات الخلايا. للقيام بذلك ، ابدأ بشطف الخلايا باستخدام وسائط Eagle المتوسطة / خليط المغذيات المعدلة من Dulbecco F-12 (DMEM / F12) وفصل الخلايا ببروتياز محايد (على سبيل المثال ، التباين ، يشار إليه من الآن فصاعدا باسم البروتياز) ، اشطفه باستخدام DMEM / F-12 ، ولوحة على شكل 30-60 مجموعات خلوية عبر 4 لوحات (6 آبار أو 10 سم) عند ~ 20٪ التقاء. قبل يومين من الحصاد ، قم بنقلها إلى حاضنة عادية (21٪ O₂ ، 5٪ CO₂). يجب أن تصل الألواح إلى ~ 80٪ من التقاء عند بدء تكوين العضوية.

2. تفكك hESCs للثقافة العضوية

1. Aliquot محلول مخزون البروتياز (5 U / mL).
   ملاحظه: عادة ما نقوم بتجميد 1 مل من الحصص عند -20 درجة مئوية للاستخدام على مدى عدة أشهر.
قم
2. بتخفيف محلول مخزون البروتياز إلى تركيز العمل عن طريق إضافة 1 مل من محلول المخزون بالإضافة إلى 5 مل من DMEM / F12 لكل لوحة 6 بئر أو 10 سم من hESCs.
3. قم بشفط وإزالة وسائط زراعة الخلايا ، ثم قم بتغطية hESCs بمحلول البروتياز. ضع الأطباق في الحاضنة لمدة 10-15 دقيقة أو حتى تدور حواف المستعمرات لأعلى وتبدأ في الانفصال عن المصفوفة.
4. قم بإمالة اللوحة ، واستنشاق محلول البروتياز ، واغسل الخلايا برفق باستخدام DMEM / F12 ثلاث مرات. استخدم 2 مل / بئر لكل غسلة عند استخدام طبق 6 آبار و 6 مل عند استخدام طبق 10 سم. تأكد من بقاء المستعمرات متصلة بالمصفوفة عند تنفيذ هذه الخطوة.
5. أضف حوالي 1.5 مل من وسائط mTESR الطازجة إلى كل بئر (أو 5 مل للوحة مقاس 10 سم) وقم بإخراج الخلايا من اللوحة باستخدام ماصة لطيفة.
6. باستخدام ماصة سعة 10 مل، قم بشفط hESC وتوزيعه برفق داخل اللوحة حتى تصل إلى 1/30 من حجمها الأصلي تقريبا. يجب أن تشبه مجموعات المستعمرات مربعات بحجم ~ 250-350 ميكرومتر عند الانتهاء من هذه الخطوات.

< p class = "jove_title" >3. توليد العضيات

1. انقل الخلايا إلى قارورة T75 واحدة منخفضة للغاية تحتوي على 30 مل من وسائط mTESR بدون عامل نمو الخلايا الليفية الأساسي (bFGF).
2. في اليوم التالي ، قم بإمالة القوارير (القوارير) بحيث تتجمع الخلايا الحية في الزاوية (قد يستغرق ذلك من 5 إلى 10 دقائق في اليوم الأول ، ولكنه سيصبح أسرع مع زيادة حجم العناقيد).
   ملاحظه: إذا كان هناك عدد كبير من الخلايا التي التصقت بأسفل القارورة في هذه الخطوة أو أي خطوات لاحقة ، فقم بنقل الخلايا إلى قارورة جديدة. من الطبيعي أن يكون لديك عدد كبير من الخلايا الميتة في اليومين الأولين. عند إجراء تغييرات في الوسائط ، تأكد من إزالة أكبر قدر ممكن من بقايا الخلية.
3. بمجرد أن تستقر الخلايا ، استنشق الوسائط والخلايا الميتة ، تاركا حوالي 10 مل من الوسائط التي تحتوي على الخلايا الحية.
4. أضف ~ 20 مل من وسائط bFGF منخفضة (DMEM / F12 مكملا ب 1x N2 ، 1x B27 ، 1x L-glutamine ، 1x من الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA) ، 0.05٪ ألبومين مصل البقر (BSA) ، و 0.1 ملي مولار أحادي الجلسرين (MTG) مكمل ب 30 نانوغرام / مل bFGF).
5. افحص الزنازين في اليوم 2. إذا كانت معظم الخلايا تبدو صحية ومشرقة ، فلا داعي لفعل أي شيء. ومع ذلك ، إذا بدا أكثر من ثلث الخلايا مظلمة ، فاستبدل الوسائط (باستخدام نفس تقنية الإمالة كما في الخطوة 3.2) ب ~ 20 مل من وسائط bFGF منخفضة مكملة ب 20 نانوغرام / مل bFGF.
6. في اليوم 3، استبدل نصف الوسائط (باستخدام تقنية الإمالة في الخطوة 3,2) ب 20 مل من وسائط bFGF منخفضة مكملة ب 10 نانوغرام/مل bFGF.
7. في اليوم 5 ، استبدل نصف الوسط (باستخدام تقنية الإمالة في الخطوة 3.2) ب 20 مل من وسائط الحث العصبي (NIM: DMEM / F12 ، 1x N2 الملحق ، 0.1 ملي MEM NEAA ، 2 ميكروغرام / مل هيبارين).
   ملاحظه: إذا كانت هناك أي مجموعات كبيرة من الخلايا أو العضيات أكبر بكثير من غيرها ، فيجب إزالتها من المزرعة. يقدر الحجم بالمظهر تحت المجهر. على سبيل المثال ، استخدام العدسة ذات الشبكة. غالبية العضيات متشابهة الحجم (حوالي 100 ± 20 ميكرومتر). أزلنا العضيات التي كانت أصغر أو أكبر بمقدار 2x تقريبا من غيرها.
8. استبدل نصف الوسط (~ 15 مل) (باستخدام تقنية الإمالة) ب NIM كل يومين.
9. بعد 3 أسابيع في المزرعة ، أضف 100x البنسلين / الستربتومايسين إلى الوسائط (NIM: DMEM / F12 ، 1x N2 supplement ، 0.1 mM MEM NEA ، 2 ميكروغرام / مل من الهيبارين) بتركيز نهائي قدره 1x إذا رغبت في ذلك. قم بتحديث الوسائط كل يوم.
   ملاحظه: بهذه الطريقة ، حافظنا على العضيات لمدة تصل إلى 6 أشهر في الثقافة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مكمل B27 جيبكو ، والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية 17504-044 bFGF لايف تكنولوجيز ، كارلسباد ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية PHG0263 جيش صرب البوسنه سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية أ 9647 متباينة STEMCELL Technologies ، فانكوفر ، كندا 7913 DMEM / F12 ثيرمو فيشر العلمي ، والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية 11330-032 DPBS جيبكو ، والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية 10010023 عامل النمو المخفض Matrigel (مصفوفة) كورنينج ، كورنينج ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية 356231 H9 hESCs WiCell ، ماديسون ، ويسكونسن ، الولايات المتحدة الأمريكية وا09 الهيبارين سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية 9041-08-01 ل-جلوتامين جيبكو ، والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية هاتف: 25030-081 أحادي الغليسرين سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية م 6145 وسائط mTESR STEMCELL Technologies ، فانكوفر ، كندا 85850 N2 NeuroPlex منتجات الجوزاء الحيوية ، غرب ساكرامنتو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية 400-163 NEAA جيبكو ، والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية 11140-050 تريتون X-100 سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية T8787-100 مل قوارير T75 منخفضة للغاية كورنينج ، كورنينج ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية 3814