عزل وثقافة الخلايا العصبية الحركية للعين والقصير الهوائية والحركية الشوكية من جنين الفأر

الملخص

Fujiki، R.، et al. عزل وثقافة الخلايا العصبية الحركية للعين والقصير الحلقي والعمود الفقري من الفئران المعدلة وراثيا قبل الولادة في Isl^mn: GFP المعدلة وراثيا. J. Vis. إكسب. (2019)

يوضح الفيديو عزل الخلايا العصبية الحركية للعين والبوقلة والحركية الشوكية عن جنين الفأر المعدل وراثيا. يعبر الجنين عن الخلايا العصبية الحركية المصنفة ببروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) لسهولة التصور والتعرف عليها. يتم عزل الخلايا العصبية الحركية جراحيا تحت المجهر الفلوري ويتم الاحتفاظ بها في وسط ثقافة.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تشريح الدماغ المتوسط البطني والحبل الشوكي

ملاحظة: قم بتنفيذ جميع الخطوات التالية باستثناء الخطوتين 1.1.1−1.1.3 و 1.1.5−1.1.6 تحت مجهر مجسم تشريح مضان عادة ما يكون إجمالي وقت التشريح لكل تجربة من 3 إلى 5 ساعات ، اعتمادا على الكفاءة في تقنية التشريح وعدد الخلايا العصبية الحركية المطلوبة لكل تجربة.

1. تسلخ الدماغ المتوسط البطني
   1. القتل الرحيم للفأر الحامل بعد حوالي 11.5 يوما من الإخصاب بغاز ثاني أكسيد الكربون وخلع عنق الرحم.
   2. رش البطن جيدا بالإيثانول وإزالة الرحم باستخدام مقص تشريح دقيق معقم وملقط تضميد الإبهام. اغسل الرحم لفترة وجيزة في محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS) ، ثم انقله إلى لوحة التشريح المملوءة ب PBS المعقم المبرد.
   3. قم بإزالة الأجنة الإيجابية ل Isl^MN: GFP (الخلايا العصبية الحركية للجزيرة: بروتين الفلورسنت الأخضر) بعناية من الرحم باستخدام مقص تشريح دقيق معقم ، ملقط تضميد الإبهام ، وملاقط Dumont # 5 في محلول ملحي معقم معقم بالفوسفات (PBS) تحت الضوء الساطع للمجهر. باستخدام ملعقة صغيرة مثقبة من Moria معقمة ، انقل كل جنين إلى بئر منفصل من صفيحة 24 بئرا مملوءة بوسط مضان منخفض Hibernate-E مبرد مسبقا مكمل ب 1x B27. احتفظ بطبق 24 جيدا على الجليد.
   4. انقل جنينا واحدا إلى صفيحة تشريح معقمة وقم بتغطيته بالكامل بمحلول ملح هانك المتوازن المعقم المثلج (HBSS).
   5. تأكد من تنفيذ خطوات التشريح تحت إضاءة الفلورسينات إيزوثيوسيانات (FITC) في المجهر. باستخدام الملقط ، قم بإزالة الذيل ووجه الجنين دون الإضرار بالدماغ المتوسط (الشكل 1Ba). ضع الجنين عرضة مع أطراف متداخلة تحتها والذيل مشيرا نحو مقدمة المجهر ، باتجاه التشريح (يشار إليه بعلامة النجمة ، الشكل 1 ب ب).
   6. باستخدام الملقط ، افتح سقف البطين الرابع لتوليد فتحة صغيرة. استخدم هذه الفتحة لربط الملقط في الفراغ الذي تم إنشاؤه بين البطين الرابع وسقفه. تشريح على طول السطح الظهري للجنين المنقاري إلى القشرة وجانبي إلى لوحة الأرضية والعمود الحركي (الشكل 1Ca ، ب). افتح الأنسجة المقطعة بطريقة كتاب مفتوح للكشف عن الخلايا العصبية الحركية للعين الإيجابية ل GFP (العصب القحفي 3 [CN3]) والخلايا العصبية البوقلية (العصب القحفي 4 [CN4]).
      ملاحظة: سيتم الآن الكشف عن قطعة صغيرة من الأنسجة من الدماغ المتوسط البطني تحتوي على اللحمة المتوسطة و CN3 و CN4.
   7. افصل الدماغ المتوسط البطني بعناية عن الجنين وقم بإزالة الأنسجة السحائية باستخدام ملاقط وسكين تشريح دقيق. قم بتشريح نوى CN3 و CN4 الثنائية الإيجابية ل GFP بعيدا عن لوحة الأرضية والأنسجة المحيطة الأخرى السلبية ل GFP باستخدام ملاقط وسكين تشريح دقيق (الشكل 1 د). تعظيم عدد الخلايا العصبية الحركية الإيجابية ل GFP في الأنسجة المستقرة ولكن تجنب لمسها أو إتلافها.
   8. إذا كانت هناك حاجة إلى مجموعة من نوى CN3 و CN4 المنفصلة ، فقم بقصها على طول خط الوسط لهاتين النواتين (الخط الأصفر المنقط في الشكل 1 د). باستخدام ماصة P1000 ، اجمع أنسجة الدماغ المتوسط البطني المقطعة مع الحد الأدنى من HBSS وضعها في أنبوب طرد مركزي دقيق 1.7 مل مليء بوسط التشريح. يحفظ على الثلج حتى التفكك.
   9. استمر في تجميع الأدمغة الوسطى البطنية من أجنة إضافية في نفس الأنبوب حتى يلبي العدد الإجمالي المتطلبات التجريبية (راجع الخطوة 4 للحصول على أرقام الخلايا المثالية).
      ملاحظة: يوصى بمجموعة مجمعة من 10 أدمغة متوسطة بطنية على الأقل تنتج ما يقرب من 1 × 10⁴ CN3 / CN4 الخلايا العصبية الحركية لأن الأنسجة تتعرض للإجهاد أثناء التفكك والفرز.
2. تشريح الحبل الشوكي البطني
   1. حافظ على الجنين عرضة بحيث يكون الرأس مواجها لمقدمة المجهر ، باتجاه التشريح. أمسك الجنين بزوج واحد من الملقط وأدخل طرف الزوج الآخر من الملقط في الجزء الذيلي غير المفتوح من البطين الرابع.
   2. افتح باقي الدماغ الخلفي والحبل الشوكي ظهريا فوق المدى المنخرجي للجنين بالكامل. افتح عن طريق قطع الأنسجة الظهرية ، بدءا من البطين الرابع والعمل باتجاه القناة المركزية للحبل الشوكي الذيلي باستخدام الملقط كمقص (الشكل 1 كاليفورنيا ، ب). احرص على تجنب لمس الحبل الشوكي البطني أو إتلافه أثناء هذا الإجراء.
   3. أمسك الجنين بزوج واحد من الملقط واضغط على سديلة الأنسجة الظهرية على كل جانب بالزوج الآخر من الملقط (الشكل 1Ea ، b).
      ملاحظة: تحتوي الأنسجة الظهرية المستأصلة على الجلد الظهري ، واللحمة المتوسطة ، والعقد الجذرية الظهرية (DRGs) ، والدماغ الخلفي الظهري ، والحبل الشوكي. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من هذه الأنسجة دون الإضرار بنواة الخلايا العصبية الحركية الشوكية (SMN) ، لأنها لاصقة ويمكن أن تحبس SMNs أثناء الترشيح أو تسبب انسدادا أثناء فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS).
   4. قم بإزالة الحبل الشوكي البطني باستخدام سكين التشريح المجهري لثقب SMN الإيجابي مباشرة ارفع الحبل الشوكي البطني بحركات تشبه المنشار على كلا الجانبين (الشكل 1Fa ، ب). قم بقص الحبل الشوكي البطني العائم بشكل عرضي فوق C1 مباشرة ، حيث يصدر أول قرن أمامي إيجابي ل GFP (الشكل 1G). أيضا ، قم بقص بشكل عرضي عند الحد العلوي للطرف السفلي (الشكل 1G). قم بإزالة الجزء العنقي (C1) - القطني (L2-L3) من الحبل الشوكي البطني بعد هذا الإجراء.
   5. ضع الجانب الظهري للحبل الشوكي البطني لأعلى واستمر بالضغط على النسيج السلبي GFP بين أعمدة SMN إيجابية GFP بزوج واحد من الملقط. قم بإزالة اللحمة المتوسطة المتبقية المرفقة ، و DRGs ، والحبل الشوكي الظهري عن طريق تقليم جانبي عمود SMN الإيجابي ل GFP بسكين التشريح المجهري (الشكل 1H). احرص على تعظيم الخلايا العصبية الحركية الإيجابية ل GFP دون إتلافها.
   6. باستخدام ماصة P1000 ، اجمع أنسجة الحبل الشوكي البطني المقطعة مع الحد الأدنى من HBSS وضعها في أنبوب الطرد المركزي الدقيق 1.7 مل المليء بوسط التشريح. يحفظ على الثلج حتى التفكك. استمر في تجميع الحبال الشوكية البطنية من أجنة إضافية في نفس الأنبوب حتى يفي العدد الإجمالي بالمتطلبات التجريبية.
      ملاحظه: يوصى بجمع ما لا يقل عن ثلاثة حبال شوكية بطنية تنتج ما يقرب من 2.1 × 10⁴ SMN لأن الأنسجة تتعرض للإجهاد أثناء التفكك والفرز.
   7. اجمع الخلايا العصبية الحركية للوجه وأطرافه أجنة الفأر Isl^MN: GFP كعناصر تحكم إيجابية ل GFP وسلبية GFP لفرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) ، على التوالي. الأطراف سلبية GFP لأن المحاور الإيجابية ل GFP في SMNs لم تمتد بعد إلى الأطراف في هذا العمر الجنيني.

فئة

2. تفكك الأنسجة

ملاحظة: عادة ما يكون إجمالي وقت التفكك 1.5 ساعة لكل تجربة.

1. غراء دافئ ومحلول مثبط الألبومين البيضي إلى 37 درجة مئوية قبل 30 دقيقة من التفكك.
2. قم بتدوير الأنسجة الدقيقة التشريح لفترة وجيزة بسرعة منخفضة.
3. باستخدام ماصة P100، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من Hibernate E بعناية دون شفط الأنسجة.
   ملاحظة: تأكد من إزالة جميع بقايا Hibernate E بعد هذه الخطوة لتجنب تقليل فعالية تفكك غراء في الخطوة التالية.
4. أضف الحجم المناسب من محلول غراء (الجدول 1) إلى كل من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.7 مل التي تحتوي على عينات الأنسجة التشريح المجهري.
   ملاحظة: تم تحديد الحجم المناسب من غراء للتفكك من أجل تعظيم التفكك الفعال مع تقليل الضغط على الخلايا.
5. قم بترتيتر 8 أضعاف برفق باستخدام ماصة P200. قم بتنفيذ جميع خطوات التجربة برفق للحفاظ على صلاحية الخلايا العصبية الحركية.
6. احتضن الأنابيب التي تحتوي على الأنسجة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، مع التقليب عن طريق النقر بالإصبع 10 مرات كل 10 دقائق. قم بتدوير الخلايا عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
7. لضمان فعالية تثبيط البويضات في الخطوة التالية ، استخدم ماصة P1000 لإزالة أكبر قدر ممكن من المواد الطافية والتخلص منها دون شفط الأنسجة.
8. أعد تعليق الكريات في الحجم المناسب من محلول مثبط الألبومين والإبويضات (الجدول 1) عن طريق التخلي برفق 8x باستخدام ماصة P200.
9. انتظر لمدة دقيقتين للسماح لأي قطع متبقية من الأنسجة غير المنفصلة بالاستقرار في قاع الأنبوب.
10. اجمع أكبر قدر ممكن من المواد الطاففية دون شفط الأنسجة غير المنفصلة باستخدام ماصة P200. انقل المادة الطافية إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة جديدة سعة 1.7 مل.
11. إذا ظلت بعض أجزاء الأنسجة غير منفصلة بعد الخطوة 2.10 ، كرر الخطوات 2.8-2.10 للأنسجة غير المنفصلة التي تبقى في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة الأصلية سعة 1.7 مل لزيادة العائد النهائي للخلايا المنفصلة مع تقليل الضغط على الخلايا المنفصلة سابقا ، الموجودة في الطاف للخطوة 2.10.
12. قم بتدوير الخلايا بحجم 300 × جم لمدة 5 دقائق.
13. أعد تعليق الحبيبات بالحجم المناسب من وسط التشريح (الجدول 1) عن طريق سحب العينة 8x باستخدام ماصة P1000. تم تحديد الحجم المناسب للتعليق النهائي بحيث لا تتجاوز كثافة الخلية 10⁷ خلايا / مل ، والتي يمكن أن تمنع تيار آلة قياس التدفق الخلوي ، ولكن أيضا بحيث لا يتم تخفيف الخلايا بشكل مفرط ، مما يؤدي إلى تباطؤ سرعة الفرز.
14. قم بتصفية المعلقات من خلال مصافي خلايا 70 ميكرومتر للتخلص من أي كتل كبيرة أو أنسجة غير مهضومة. انقل المعلقات إلى أنابيب اختبار البوليسترين ذات القاع المستدير سعة 5 مل واحفظها على الثلج لحين الحاجة.

فئة

3. فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS)

فئة

ملاحظة: تم تحسين هذا البروتوكول باستخدام فارز FACS مزود بليزر بنفسجي 15 ميجاوات 405 نانومتر ، وليزر أزرق 100 ميجاوات 488 نانومتر ، وليزر برتقالي 75 ميجاوات 594 نانومتر ، وليزر أحمر 40 ميجاوات 640 نانومتر. تم فرز الخلايا كسائل غمد في PBS معقم في ظل ظروف معقمة من خلال فوهة 100 ميكرومتر. من أجل تقليل إجهاد الخلية ، تم ضبط معدل التدفق على ضغط عينة من 1-3 ، بحيث تم الحصول على 1,000-4,000 حدث كحد أقصى في الثانية. عادة ما يكون إجمالي وقت FACS 1-2 ساعة لكل تجربة.

1. قم بإعداد الفولتية للتشتت الأمامي والجانبي بحيث يمكن تصور عدد الخلايا بشكل صحيح. يعد إعداد الفولتية المناسبة لفرز الخلايا أمرا معقدا ويتطلب مشغل FACS متمرسا.
2. للتمييز بين مجموعات الخلايا المختلفة ، ارسم الخلايا بناء على الحجم كما هو محدد بواسطة منطقة التشتت الأمامي (FSC-A) مقابل التعقيد الداخلي كما تحدده منطقة التشتت الجانبي (SSC-A). ارسم بوابة حول الخلايا الحية كما هو موضح في الشكل 2Aa والشكل Ba لاستبعاد الحطام والخلايا الميتة. قم بتجميع الخلايا داخل المنطقة المسورة كمجموعة سكانية 1 (P1).
3. لاستبعاد كتل الخلايا والمزدوجات ، ارسم خلايا P1 التالية بناء على عرض التشتت الجانبي (SSC-W) مقابل SSC-A. بوابة عدد الخلايا المفردة كمجموعة سكانية 2 (P2) (الشكل 2Ab والشكل Bb).
4. ارسم خلايا P2 بناء على عرض التشتت الأمامي (FSC-W) مقابل FSC-A وقم ببوابة سكان الخلايا المفردة كمجموعة سكانية 3 (P3) (الشكل 2Ac والشكل BC).
   ملاحظه: يستثني استخدام بوابتين متتاليتين في 3.3 و 3.4 كتل الخلايا والمزدوجات (FSC-W عالية و FSC-A عالية).
5. تعتمد خلايا البوابة P3 على GFP مقابل allophycocyanin (APC). تكتشف قناة APC التألق الذاتي. تتجنب البوابات على هذه القناة التقاط الخلايا الفلورية الذاتية. استخدم الخلايا السالبة GFP لضبط الجهد لقنوات الفلورسنت FITC / GFP. من الناحية المثالية ، ضع بوابات لمجموعات الخلايا هذه حوالي 10². حدد عتبات البوابة للسكان الإيجابيين الإيجابيين 4 (P4) بشكل فردي لكل نوع من أنواع الخلايا العصبية الحركية (الشكل 2Ad والشكل Bd).
   ملاحظة: قم بتعيين بوابة GFP أعلى بكثير ل SMNs مقارنة ب CN3s / CN4s من أجل الحصول على ثقافة نقية (الشكل 2Ad والشكل Bd). تؤدي بوابة GFP المنخفضة لثقافات SMN إلى تلوث الثقافات بواسطة الخلايا الدبقية والخلايا العصبية غير الحركية. هذا على الأرجح بسبب وجود تعبير GFP منخفض المستوى في بعض الخلايا الدبقية والخلايا العصبية غير الحركية بسبب محفز متسرب. عادة ما تكون النسبة المئوية للخلايا الإيجابية ل GFP مقارنة بإجمالي الخلايا 0.5-1.5٪ ل CN3s / CN4s و 1.5-2.5٪ ل SMNs. إذا كان التشريح ناجحا ، فيمكن استخدام هذه الأرقام كمعيار لتحديد الموضع المناسب للبوابة الإيجابية للبرنامج التأسيسي العالمي (الشكل 2Ae والشكل Be).
6. قم بإجراء FACS وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. اجمع خلايا P4 في أنابيب طرد مركزي دقيقة جديدة سعة 1.7 مل مملوءة ب 500 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا العصبية الحركية. يحفظ على الثلج حتى الطلاء.
   ملاحظه: على الرغم من أنه يمكن فرز الخلايا مباشرة في الآبار ، إلا أن هذا ينتج عنه عدد غير متساو من الخلايا لكل بئر. قم بفرز الخلايا إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.75 مل ثم قم بتقطيعها يدويا من أجل تحقيق توزيع طلاء أكثر توازنا.

< p class = "jove_title" >4. ثقافة الخلايا العصبية الحركية الأولية المنقاة

1. تمييع معلقات CN3 / CN4 و SMN المعزولة ب FACS مع وسط ثقافة الخلايا العصبية الحركية المسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية إلى كثافات 5 × 10³ و 1 × 10⁴ خلايا / مل ، على التوالي.
   ملاحظه: ينتج جنين واحد E11.5 حوالي 1 × 10³ CN3 / CN4 و 7 × 10³ SMN. ومع ذلك ، فإن هذه العوائد تعتمد بشكل كبير على نقاء الأنسجة المقطعة ، وشمولية تفكك الخلايا ، والعتبة المناسبة لبوابات GFP أثناء FACS.
2. انقل 96 لوحا جيدا مطلية مسبقا ببولي D-lysine (PDL) واللامينين من حاضنة زراعة الأنسجة 37 درجة مئوية إلى غطاء التدفق الصفحي وشفط اللامينين من كل بئر. استخدم الأطباق والأغطية على الفور دون غسلها.
3. أضف 200 ميكرولتر من معلقات CN3 / CN4 المخففة و SMN في كل بئر من ألواح 96 بئر مطلية ب PDL / laminin. يجب أن تكون كثافة الخلايا النهائية 1 × 10³ و 2 × 10³ خلايا / بئر ل CN3 / CN4 و SMN ، على التوالي.
   ملاحظه: كثافة الطلاء الأولية ل SMNs في 96 لوحة بئر (2 × 10³ خلايا / بئر) هي ضعف كثافة CN3s / CN4s (1 × 10³ خلايا / بئر) من أجل الحصول على أعداد وكثافات الخلايا العصبية الحركية النهائية المماثلة في 2 و 9 أيام في المختبر (DIV) (4-6 × 10² و 2-4 × 10² خلية لكل بئر ، على التوالي).
4. زراعة الخلايا العصبية في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
5. قم بتغذية الخلايا العصبية كل 5 أيام عن طريق إزالة نصف الوسائط القديمة (100 ميكرولتر) واستبدالها بنفس الحجم من وسط زراعة الخلايا العصبية الحركية الطازجة. تأكد من أن العمليات العصبية تصبح مرئية على 1 DIV وتصبح أكثر سمكا وأطول بمقدار 14 DIV (الشكل 3). تتضخم أجسام الخلايا العصبية وتميل إلى التجمع في الثقافات طويلة المدى ، خاصة بالنسبة للشبكات الصغيرة والمتوسطة (الشكل 3).
   ملاحظة: قم بإجراء جميع التغييرات المتوسطة والمحلول عن طريق ترك نصف الحجم المتوسط الأصلي لتجنب فصل الخلايا المستنبتة. يتضمن ذلك خطوات التثبيت والكيمياء المناعية (ICC). إذا تمت إزالة جميع الوسائط ، بغض النظر عن مدى اللطف ، فسوف تنفصل معظم الخلايا وتغسلها.

النتائج

p class = "jove_content" >الجدول 1: الكميات المناسبة من غراء ، والألبومين - البيضي ، والتعليق النهائي المستخدم في خطوات التفكك. تم تعديل الكميات المناسبة من غراء والألبومين البيضي لاستخدامها مع أعداد مختلفة من أنسجة الدماغ المتوسط البطني والحبل الشوكي البطني من تعليمات الشركة المصنعة بعد عدة جولات من التحسين. نظرا لأن الأنسجة تتعرض للإجهاد أثناء التفكك والفرز ، يوصى بمجموعة مجمعة من أكثر من 10 أدمغة متوسطة بطنية وأكثر من ثلاثة حبال شوكية بطنية. تم تحديد حجم غراء من خلال النظر في التوازن بين التفكك الفعال والضغط الناتج عن...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مكمل B27 (50X) ، خال من المصل ثيرمو فيشر العلمي 17504-044 BD FACSAria llu SORP مقياس التدفق الخلوي BD Bioscience - يحتوي هذا على 4 أنظمة ليزر مجهزة ب 405 و 488 و 594 و 640 نانومتر. مصافي خلايا النايلون BD Falcon 70μm كورنينج هاتف: 352350 لتصفية الخلايا المنفصلة قبل FACS. BD Falcon أنابيب اختبار القاع المستديرة مع غطاء المفاجئة كورنينج 352054 BDNF الإنسان ProSpec-Tany TechnoGene، المحدودة سي يت-207 صفيحة دقيقة لثقافة الخلية ، 96 بئر ، PS ، F-bottom (بئر المدخنة) غرينر بيو ون انترناشيونال 655090 لقد جربنا العديد من الأطباق المكونة من 96 بئرا وكان هذا هو الأفضل للثقافة والتحليلات بعد ICC CNTF الإنسان ProSpec-Tany TechnoGene، المحدودة سي يت-272 4 ′ ، 6-دياميدينو -2-فينيلينودول (DAPI) ثيرمو فيشر العلمي د1306 ثنائي ميثيل سلفوكسيد سيجما ألدريتش د2650 DMSO Dumont # 5 ملقط طرف إينوكس مقاس .05 × .01 مم نصائح بيولوجي أداة Roboz الجراحية RS-5015 فورسكولين ثيرمو فيشر العلمي BP25205 GDNF الإنسان ProSpec-Tany TechnoGene، المحدودة سي يت-305 مكمل GlutaMAX ثيرمو فيشر العلمي 35050-061 محلول الملح المتوازن من هانكس (HBSS) ثيرمو فيشر العلمي 14175-095 السبات E برين بيتس هو السبات E مضان منخفض برين بيتس رف يجب أن يكون التألق الذي يعيق ملاحظة تعبيرات GFP للجنين منخفضا. مصل الحصان ، معطل الحرارة ، أصل نيوزيلندي ثيرمو فيشر العلمي هاتف: 26050-070 آي بي إم إكس توكرس كوكسون 2845 م إيزوبوتيل ميثيل زانثين لامينين ثيرمو فيشر العلمي 23017-015 ليبوفيتز L15 متوسط ثيرمو فيشر العلمي 11415064 2-ميركابتو إيثانول سيجما ألدريتش M6250 مقص تشريح دقيق أداة Roboz الجراحية RS-5913 سكين صغير 4.75 بوصة 1.7 × 27 مم شفرة أداة Roboz الجراحية RS-6272 موريا ملعقة صغيرة مثقبة أدوات العلوم الدقيقة 10370-19 أوليمبوس 1.7 مل أنابيب دقيقة ، شفافة جينيسي العلمية 22-281 هذه هي الأنابيب التي وصفناها "أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.7 مل" في السياق. نظام تفكك غراء شركة ورثينجتون للكيمياء الحيوية LK003150 يتم تحضير محلول غراء ومحلول مثبط البيضات من هذه المجموعة. البنسلين الستربتومايسين (10,000 وحدة / مل) ثيرمو فيشر العلمي 15140-122 محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ثيرمو فيشر العلمي 10010-023 بولي دي ليسين (PDL) MilliporeSigma أ -003 ه SMZ18 والمجاهر المجسمة للتكبير / التصغير SMZ1500 مع كاميرا DS-Ri1 نيكون - تم إجراء التشريح وتم التقاط صور للأجنة والأنسجة المقطعة تحت هذه المجاهر الفلورية. سيلجارد 170 مغلف سيليكون أسود - مجموعة A + B 0.9 كجم داو كورنينج 1696157 نصنع أطباق تشريح باستخدام هذه المجموعة. أطباق معالجة بتقنية TC ، 100 × 20 مم جينيسي العلمية 25-202 نصنع أطباق تشريح باستخدام هذا الطبق. ملقط ضمادة Thum مقاس 4.5 بوصة مسنن 2.2 مم عرض الطرف أداة Roboz الجراحية RS-8100 مجهر متحد البؤر للمسح الضوئي بالليزر من سلسلة Zeiss LSM 700 وبرنامج Zen كارل زايس - تم التقاط صورة متحد البؤر للجنين باستخدام هذه المعدات