التعامل مع مزارع الخلايا الجذعية العصبية في منشأة إنتاج الخلايا

الملخص

المصدر: Stover ، A. E. ، et al. زراعة الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات والعصبية في نظام زراعة الخلايا المغلق للأبحاث الأساسية وقبل السريرية. J. Vis. Exp. (2016).

يوضح الفيديو إجراءات الحفاظ على بيئة خاضعة للرقابة في محطة عمل زراعة الخلايا لنمو الخلايا الجذعية العصبية والحفاظ عليها. تتضمن هذه الإجراءات وضع ظروف الغرفة وبروتوكولات التنظيف وإعداد الوسائط ، وبالتالي الحفاظ على أقصى قدر من العقم والاستنساخ واستبدال الطرق التقليدية.

البروتوكول

1. الإعداد الأولي

1. ضبط تركيزات الغاز ودرجة الحرارة
   1. باستخدام البرنامج ، انقر فوق علامة التبويب "ضيف" في الزاوية اليسرى العليا من الواجهة الرسومية. قم بتسجيل الدخول إلى النظام باستخدام اسم مستخدم وكلمة مرور معينين. تأكد من أن كل مستخدم لديه اسم المستخدم وكلمة المرور الخاصة به.
   2. انقر فوق وحدة لضبطها (الشكل 1). ضمن النافذة الجديدة التي تعرض الإعدادات الحالية ، انقر فوق قيمة نقطة التعيين O₂ الحالية أسفل "تعيين النقطة" وأدخل مستوى تركيز O₂ المطلوب لهذه الوحدة. أدخل 5٪ O₂ إذا كانت الخلايا الجذعية متعددة القدرات ستزرع أو يتم التلاعب بها في هذه الوحدة و 9٪ O₂ إذا تم زراعة الخلايا الجذعية العصبية أو التلاعب بها. انقر فوق علامة الاختيار الخضراء لتأكيد النقطة المحددة.
      ملاحظه: وحدتان غير قابلتين للتعديل بالغاز: غطاء المحرك الرقائقي وغرفة المجهر. تركيزات الغاز في غطاء التدفق الصفحي هي في الغلاف الجوي ، بينما تحافظ تلك الموجودة في غرفة المعالجة بشكل سلبي على تلك الموجودة في غرفة المجهر.
   3. كرر هذه الخطوة لثاني أكسيد الكربون₂. أدخل نقطة ضبط بنسبة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون₂ لجميع الوحدات النمطية باستثناء الغرف العازلة، التي يتم ضبطها فقط ل O₂.
   4. راقب تركيزات الغاز الحالية المسماة "قيم العملية" للتأكد من وصولها إلى نقاط الضبط الجديدة.
   5. اضبط نقاط ضبط الغاز لجميع الوحدات على القيم المناسبة. تطابق مستويات ثاني أكسيد الكربون₂ و O₂ للغرف التي ستتعرض لبعضها البعض. على سبيل المثال ، اضبط غرفة المعالجة على 5٪ O₂ قبل فتح حاضنة تنمو الخلايا عند 5٪ O₂. أيضا، قم بالتغيير إلى 5٪ O₂ في أي غرفة عازلة تستخدم لإضافة عناصر إلى غرفة العملية خلال هذا الوقت.
   6. اضبط درجة حرارة غرفة المعالجة على 37 درجة مئوية باستخدام نفس الشاشة لتعديلات الغاز. أيضا ، يجب ضبط درجة حرارة أرضية غرفة العملية على 37 درجة مئوية.
   7. انقر فوق بنوك وحدة الحضانة أسفل كل حاضنة. اضبط درجة حرارة البنوك على 37 درجة مئوية.
2. تشغيل الغرف العازلة
   1. اجمع كل المستلزمات المطلوبة للمهمة المحددة (التغذية ، والتقسيم ، والتلوين ، وما إلى ذلك) في البداية لمنع التأخير في سير العمل. رش جميع المواد بكمية 70٪ من الإيثانول واتركها تجف في الغطاء الرقائقي. لا ترش قوارير أو ألواح من الخلايا - امسحها برفق باستخدام إسفنجة شاش معقمة مشبعة بنسبة 70٪ من الإيثانول.
   2. تأكد من إغلاق الأبواب الخارجية والداخلية للغرفة العازلة بإحكام. ثم افتح الباب الخارجي وضع العناصر بالداخل.
   3. أغلق الباب الخارجي. حدد وحدة المخزن المؤقت داخل البرنامج وانقر فوق علامة التبويب عامل التخفيف. أدخل واحدا في مربع عامل السجل. انقر فوق start.
      ملاحظة: يعني "عامل التخفيف" أنه سيتم إخلاء الغلاف الجوي للوحدة العازلة واستبداله مرة واحدة بغاز نظيف مفلتر بتقنية HEPA.
   4. بمجرد أن تتوقف الواجهة الرسومية عن وميض "عامل التخفيف" ، افتح الباب الداخلي للغرفة العازلة وأحضر المواد داخل غرفة العملية.
      تحذير: لا تسمح للأبواب الداخلية والخارجية بفتح الأبواب في وقت واحد ، ولا تفتح الباب الداخلي إذا لم تخضع الغرفة العازلة لعامل تخفيف.
   5. أولا ، قم بإزالة العناصر من غرفة المعالجة وتأكد من أن الغرفة العازلة قد خضعت لعامل تخفيف. ثم افتح الباب الداخلي ، ضع العناصر المراد إزالتها بالداخل ، وأغلق الباب الداخلي. ثم افتح الباب الخارجي وقم بإزالة العناصر.
      ملاحظة: يجب عدم تشغيل عامل التخفيف قبل فتح الباب الخارجي.

< p class = "jove_title" >2. إدخال الخلايا وتغذيتها

1. إعداد الحاضنة
   1. ضع 3 أطباق بتري في وعاء الماء في قاعدة كل حاضنة. املأ هذه الأطباق بالماء المعقم ، وليس ملء المقلاة مباشرة. حافظ على مستوى الماء في هذه الأطباق ، لأنها ضرورية للحفاظ على نقطة ضبط الرطوبة النسبية (RH) للحاضنات.
   2. داخل الواجهة الرسومية ، انقر فوق الحاضنة. ضمن نقطة الضبط ، انقر فوق قيمة الرطوبة النسبية (RH) الحالية وأدخل 85٪. انقر فوق علامة الاختيار الخضراء لقبول هذه القيمة.
2. إعداد منشأة إنتاج الخلايا للخلايا
   1. إذا لم يتم ذلك بالفعل ، فاضبط الغرف العازلة وغرفة المعالجة والحاضنة على نقاط ضبط الغاز المطلوبة لنوع الخلية التي يتم إدخالها.
   2. نظف سطح حجرة المعالجة بشاش معقم ومطهر غير قابل للاشتعال. لا تستخدم أي مطهر يحتوي على حمض البيراسيتيك. في النظام المغلق ، تكون الأبخرة القوية العالقة سامة لخلايا الثدييات. بدلا من ذلك ، استخدم المنتجات القائمة على كلوريد البنزالكونيوم.
   3. استمر في التطهير. نظف القفازات والأسطح التي يتم لمسها بشكل شائع، مثل مقابض الأبواب. استخدم المطهر جيدا ولكن باعتدال ، لأن السائل الزائد في غرفة المعالجة سيساهم في الرطوبة والتكثيف والنمو الميكروبي المحتمل.
   4. نظف سطح غطاء التدفق الرقائقي والغرفة العازلة بنسبة 70٪ من الإيثانول واتركه حتى يجف. ضع قارورة أو صفيحة الخلايا (في حالتنا ، PSCs (الخلايا الجذعية متعددة القدرات) أو الخلايا الجذعية العصبية (الخلايا الجذعية العصبية)) في غطاء المحرك وامسح سطحها الخارجي لفترة وجيزة باستخدام إسفنجة شاش معقمة مشبعة بالإيثانول.
   5. ضع القارورة أو اللوحة في الغرفة العازلة وقم بتشغيل عامل التخفيف (الخطوة 1.2.3).
   6. عند الانتهاء من عامل التخفيف ، انقل القارورة أو اللوحة على الفور إلى الحاضنة المناسبة. نظرا لأن الحاضنات موجودة في الجزء الخلفي من غرفة المعالجة ، اسحب رفا إلى غرفة المعالجة لوضع الخلية. تجنب فتح أبواب الحاضنة دون داع أو لفترات طويلة ، حيث أن هواء غرفة المعالجة جاف جدا مقارنة بهواء الحاضنات وسيؤدي إلى فقدان كبير للرطوبة في الحاضنة.
تغذية
3. مزارع الخلايا
   1. اجمع المكونات المتوسطة، مثل الماصات المصلية والماصة الإلكترونية والشاش والمطهر. أيضا ، اجمع حاوية نفايات لوسط زراعة الخلايا المستهلكة ، لكن لا تملأها بالتبيض. أحضر المواد إلى غرفة المعالجة من خلال غرفة عازلة كما هو موضح في القسم 1.2. رتب المواد لتمكين مساحة العمل المثلى. تجنب وضع العناصر التي لا يتم استخدامها في وسط غرفة العملية.
   2. اترك حاوية الوسائط غير مغطاة قليلا للسماح للوسيط بالتوازن مع مستويات ثاني أكسيد الكربون₂ وO₂ الموجودة داخل النظام. يشير بعض مصنعي وسائط PSC إلى عدم تسخين الوسائط عند 37 درجة مئوية ؛ إذا كان الأمر كذلك ، فاستخدم غرفة عازلة لموازنة الوسط. اسمح للوسيط بالتوازن لمدة 20 دقيقة.
   3. قم بإزالة الوسط القديم من الآبار باستخدام ماصة مجسمة مناسبة وماصة إلكترونية. بالنسبة إلى PSCs ، قم بإزالة كل الكمية المتبقية باستثناء كمية صغيرة متبقية من الوسط القديم لمنع الجفاف أثناء عملية التغذية. بالنسبة لمراكز الأمن القومي ، قم بإزالة نصف الوسيط القديم. قم بسحب النفايات في حاوية النفايات.
   4. ضع الماصة المستخدمة مرة أخرى في غلافها الأصلي وانقلها إلى جانب حجرة المعالجة أو في غرفة عازلة مخصصة لإزالة النفايات. باستخدام ماصة مصلية معقمة جديدة، أضف وسطا جديدا إلى ألواح زراعة الخلايا وضع الألواح مرة أخرى في الحاضنة المخصصة لها.
   5. في نهاية التغذية ، قم برش الشاش بالمطهر وتنظيف الأرضية ومقابض الأبواب في غرفة المعالجة جيدا. إذا كانت هناك خطوط خلوية متعددة في النظام ، فقم بتعقيمها بين تغذية كل خط خلية. هذا يساعد على تقليل مخاطر التلوث المتبادل.
   6. قم بإزالة النفايات أو الأشياء الأخرى غير الضرورية من خلال إحدى الغرف العازلة عند الانتهاء.

< p class = "jove_title" >3. تقسيم مزارع الخلايا

1. المرور الأنزيمي ل PSCs أو NSCs
   1. اجمع كل العناصر اللازمة للمرور. يتضمن ذلك الوسائط أو الإنزيم أو المخزن المؤقت لتفكك الخلايا غير الأنزيمية (الأخير مخصص ل NSCs فقط) ، و DPBS (محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco) ، وألواح أو قوارير ، ومصفوفة خارج الخلية (ECM) ، وأنابيب مخروطية ، وماصات مصلية. أحضرهم إلى النظام باستخدام غرفة عازلة.
   2. قم بتغطية الأطباق أو القوارير الطازجة ب ECM ، كما هو موضح سابقا 9,10. بعض ECMs - مثل تلك المشتقة من خطوط خلايا ساركوما الفأر - تكون سائلة فقط بين 4 و 15 درجة مئوية ، لذا استخدم كتلة باردة معقمة أو كيس ثلج هلامي للحفاظ على برودة ECM أثناء العمل في غرفة المعالجة الساخنة.
   3. قم بإخراج الوسط المستهلك من الثقافة وتخلص منه في حاوية النفايات.
   4. اشطف سطح البئر أو القارورة باستخدام 1 مل من DPBS / البئر وتخلص من DPBS.
   5. أضف 1-2 مل من الإنزيم الدافئ إلى كل بئر. تتطلب الثقافات الكثيفة جدا فقط 2 مل.
   6. انقل طبق الثقافة أو القارورة على الفور إلى غرفة المجهر وراقب الثقافة. راقب علامات الخلايا الفردية التي تبدأ في التفكيك من الطبق. لا تنتظر حتى تطفو الخلايا في التعليق قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
   7. أعد الخلايا إلى غرفة المعالجة الرئيسية. باستخدام ماصة مصلية سعة 5 مل ، أضف 4 مل من DPBS لكل 1 مل من الإنزيم ، ثم قم بسحب الأنبوب بقوة لأعلى ولأسفل لإخراج الخلايا من سطح البئر. في حالة المرور بآبار متعددة داخل صفيحة متعددة الجدران ، أضف DPBS إلى كل بئر قبل إزاحة الخلايا من الآبار الفردية.
   8. انقل تعليق الإنزيم وخلية PBS إلى أنبوب مخروطي بحجم مناسب.
   9. إذا لم يكن جهاز الطرد المركزي متوفرا في منشأة إنتاج الخلايا ، فقم بإغلاق الأنبوب المخروطي بإحكام ، وضعه في غرفة عازلة ، وأغلق الباب.
   10. قم بإزالة الأنبوب المخروطي من الغرفة العازلة من جانب التدفق الصفحي وقم بتدوير الخلايا عند 100 × جم لمدة 5 دقائق في RT.
   11. رش الأنبوب المخروطي بنسبة 70٪ من الإيثانول وأدخله إلى غرفة المعالجة باستخدام غرفة عازلة وعامل تخفيف.
   12. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا في 2 مل من وسط PSC أو NSC. في حالة مرور PSCs ، قم بتضمين مثبط ROCK (بروتين كيناز المرتبط ب Rho) في الوسط بتركيز 10 ميكرومتر.
   13. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم وتحديد الآبار أو الألواح المطلوبة. لوحة PSCs عند 5 × 10⁴ - 1 × 10⁵ خلايا / سم². تقسيم NSCs بنسبة 1: 2.
       ملاحظة: غالبا ما تتكتل الخلايا العصبية العصبية وتقاوم العد الدقيق في مقياس كثافة الدم.
   14. إذا كانت الحفظ بالتبريد للخلايا مطلوبة، فتأكد من تحضير جميع المستلزمات ووسائط التجميد ووضعها داخل غرفة المعالجة. DMSO (ثنائي ميثيل سلفوكسيد) شديد السمية للخلايا عند 37 درجة مئوية ، لذلك فهو يعمل بسرعة. احتفظ بحاوية التجميد المغلفة بالأيزوبروبانول في RT في غطاء التدفق الرقائقي. بمجرد ملء قوارير الحفظ بالتبريد وإغلاقها ، قم بإزالتها على الفور من غرفة المعالجة عن طريق تمريرها عبر غرفة عازلة.
2. المرور اليدوي لمراكز PSC
   1. تأكد من أن الثقافة بحاجة إلى اجتياز ، كما هو موضح سابقا. إذا كان الأمر كذلك ، فقم بإعداد أطباق أو قوارير طازجة مغطاة بمصفوفة خارج الخلية. ثم قم بتغيير الوسيط تماما.
   2. نظف حجرة المجهر بشاش معقم مبلل بكمية احتياطية من المطهر غير القابل للاشتعال - سيؤدي الإفراط في تناوله إلى تعفير زائد. نظف فقط القفازات ومساحة الأرضية والمرحلة. أحضر العديد من أطراف الماصات الملفوفة بشكل فردي سعة 200 ميكرولتر أو 1,000 ميكرولتر إلى الغرفة.
   3. أحضر لوحة PSCs إلى غرفة المجهر ، وقم بإزالة الغطاء ، وضعها ووجهها لأسفل على الأرضية التي تم تنظيفها حديثا. يؤدي ترك الغطاء لأعلى إلى تعريض الجانب السفلي مباشرة للتيارات الهوائية والتلوث المحتمل.
   4. قم بفك طرف الماصة ، واستخدم المجهر لتصور الثقافة ، وقم بفصل المستعمرات ذات التشكل الجيد باستخدام طرف الماصة.
      ملاحظة: قد يتم توصيل طرف الماصة بالماصة إذا وجد المستخدم الفردي هذا الأمر أكثر راحة.
   5. أعد تركيب الغطاء الموجود على اللوحة وحرك اللوحة مرة أخرى إلى غرفة المعالجة.
   قم
   6. بإزالة ECM الزائدة من اللوحة الجديدة ونقل الوسائط من اللوحة القديمة (التي تحتوي على قطع المستعمرة المعلقة) إلى اللوحة الجديدة. إذا كانت اللوحة القديمة لا تزال تحتوي على مستعمرات غير جاهزة للقطف ، فقم بإطعامها أيضا.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1. واجهة رسومية لمنشأة إنتاج الخلايا. (أ) التمثيل الرسومي ل CPF هو الشاشة الافتراضية ويتطابق مع رسم CAD الموضح في الشكل 3. يؤدي النقر بالماوس فوق الوحدة النمطية 1 إلى فتح شاشة التحكم الخاصة بها (B)، حيث يتم تعيين قيم O₂ لمطابقة غرفة المعالجة. وبالمثل ، يؤدي النقر فوق غرفة المعالجة أو الحاضنة 1 إلى إظهار شاشات التحكم الخاصة بكل منهما (

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات نظام Xvivo بيوسفيريكس حسب الطلب برنامج Xvivo بيوسفيريكس الإصدار I.o.2.1.2.1 O2 المشعب أميكو P-M2H-C3-S-U-أوكسي مشعب CO2 أميكو M2H-C3-D-U-CO2 N2 المشعب المبتكر الغربي CTM75-7-2-2-BM غاز O2 غاز ثاني أكسيد الكربون غاز N2 طبق بتري الماء شاش معقم 70٪ إيثانول BDH BDH1164-4 لب مطهر قائم على كلوريد البنزالكونيوم محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco المخزن المؤقت لتفكك الخلية المستند إلى هانك تقنيات الحياة 13150-016 2 مل ماصة مصلية VWR 89130-894 5 مل ماصة مصلية أوليمبوس بلاستيك 12-102 10 مل ماصة مصلية أوليمبوس بلاستيك 12-104 25 مل ماصة مصلية أوليمبوس بلاستيك 12-106 50 مل ماصة مصلية أوليمبوس بلاستيك 12-107 6 آبار لوحة كورنينج 353046 أطراف ماصة 20uL إيبندورف 22491130 أطراف ماصة 200uL إيبندورف 22491148 1000 طرف ماصة إيبندورف 22491156 مجهر مع كاميرا DP21 ومضان شركة أوليمبوس CKX41 الصوديوم المخزن بالفوسفات هيكلون 9236 ثنائي ميثيل سلفوكسيد البروتيد ص 1130 القفازات