مقالة منهجية

تنقية خلايا السلائف البطانية CD31 + باستخدام فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Matsuo، K.، et al. تمايز الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة عن طريق الإنسان إلى خلايا شبيهة بالخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة في الدماغ ذات النمط الظاهري المناعي الناضج. J. Vis. Exp. (2023).

يوضح هذا الفيديو تقنية لتنقية الخلايا السلفية البطانية CD31 + (EPCs) من مزرعة باستخدام فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا (MACS). يتم معالجة تعليق الخلية بجسم مضاد مترافق بالفلوروفور يرتبط ب CD31 على EPCs. يتضمن استكمال وضع العلامات على CD31 + EPCs إضافة مركب أجسام مضادة ، يرتبط بالفلوروفورات ، وجسيم نانوي مغناطيسي مطلي بالبوليمر ، والذي يرتبط بمركب الجسم المضاد. ثم يتم تنقية الخلايا المسماة باستخدام مجال مغناطيسي ، والتخلص من أي خلايا CD31.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم توفير خط الخلايا الجذعية متعددة القدرات (hiPSC) المستحث البشري ، HPS1006 ، من قبل RIKEN BRC من خلال المشروع الوطني للموارد الحيوية التابع ل MEXT / AMED ، اليابان.

< p class = "jove_title" >1. تحريض تمايز hiPSC في الخلايا السلفية البطانية (EPCs)

  1. الألواح والكواشف المطلية بالمصفوفة خارج الخلية (ECM)
    1. قم بإعداد ألواح 12 بئرا مطلية بمصفوفة غشاء القاعدي عن طريق نقل 2.5 مجم من هلام المصفوفة إلى أنابيب طرد مركزي سعة 50 مل للتخزين عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر. أضف 30 مل من خليط النسر المتوسط / المغذي المعدل البارد F-12 (DMEM / F12) ، والذي تم حفظه في الثلاجة (4 درجات مئوية) ، في الأنبوب. اخلطيها برفق عن طريق سحب العينات حتى يذوب الجل ثم أضيفي 500 ميكرولتر من المحلول إلى كل بئر من اللوحة المكونة من 12 بئرا. ضع الطبق في حاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2) لمدة 1 ساعة على الأقل < / > ملاحظه: جل مصفوفة الغشاء القاعدي حساس لدرجة الحرارة ويجب التعامل معه وفقا لتعليمات الشركة المصنعة للنقل وطلاء اللوحة. يمكن أن يختلف تركيز بروتينات المصفوفة خارج الخلية بين الدفعات. لضمان الدقة ، يجب الإشارة إلى التركيز الدقيق في ورقة شهادة الجودة للدفعة المحددة ، باستخدام رقم الدفعة. على سبيل المثال ، إذا كان التركيز الدقيق 10.0 مجم / مل ، فاستخدم 250 ميكرولتر من الجل ليصبح المجموع 2.5 مجم.
    2. قم بإعداد محلول مخزون مثبط rho-kinase (ROCK) عن طريق إذابة مثبط ROCK في ماء معقم بتركيز 10 ملي مولار (الجدول 1). قم بتخزين محلول المخزون بأحجام 100-200 ميكرولتر وتخزينه عند -20 درجة مئوية لتجنب دورات التجميد والذوبان.
    3. اصنع محلول مخزون 100 مجم / مل من حمض الأسكوربيك عن طريق إذابة 5 جم من حمض الأسكوربيك في 50 مل من الماء المعقم وتخزينه في -20 درجة مئوية (الجدول 1). أضف 6.25 مل من الجلوتامين و 305 ميكرولتر من محلول مخزون حمض الأسكوربيك في 500 مل من DMEM / F12 المتقدم لعمل وسط LaSR (الجدول 1). يحفظ في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
    4. تحضير محلول CHIR99021 عن طريق إذابة CHIR99021 في ثنائي ميثيل سلفوكسيد غير مخفف (DMSO) إلى تركيز نهائي يبلغ 10 ملي مولار (الجدول 1). قم بتقسيم المحلول إلى أحجام 100-200 ميكرولتر لتجنب دورات التجميد والذوبان وتخزينه عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 سنة. قم بتخزين حصص العمل من محلول المخزون عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
    5. تحضير وسط DMEM/F12-10 عن طريق إضافة 50 مل من مصل الأبقار الجنينية المعطل بالحرارة إلى 450 مل من DMEM/F12. قم بتخزين الوسط في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد (الجدول 1).
    6. قم بإعداد المخزن المؤقت للتدفق -1 عن طريق إضافة 33.3 مل من ألبومين مصل الأبقار بنسبة 7.5٪ (BSA) إلى 467 مل من محلول ملحي Dulbecco المخزن بالفوسفات (PBS) (الجدول 1). يحفظ في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
  2. تلقيح hiPSCs المفردة والتوسع لتمايز EPC (اليوم -3 إلى اليوم -1)
    1. ابدأ التمايز عندما لا تظهر مستعمرات hiPSC في صفيحة 6 آبار أي تمايز تلقائي ولها الكثافة المناسبة للمرور ، عادة حوالي 80٪ التقاء (2.5-3.5 × 106 خلايا). راقب بعناية الخلايا المتمايزة تلقائيا تحت المجهر للتأكد مما إذا كانت هناك حاجة إلى ممرات متعددة للقضاء على الخلايا غير المتمايزة. راجع الملاحظة الواردة أدناه الخطوة 1.4.15 للحصول على معلومات حول وسط زراعة الخلايا والمصفوفة خارج الخلية.
    2. قم بشفط الوسط وإضافة 1 مل من كاشف التفكك إلى الآبار واحتضانه لمدة 5-7 دقائق عند 37 درجة مئوية. قم بفصل الخلايا وتفردها عن طريق سحب محلول كاشف التفكك برفق على أسطح الآبار مرتين أو ثلاث مرات.
    3. انقل الخلايا المنفصلة إلى أنبوب سعة 15 مل يحتوي على 4 مل من وسط صيانة hiPSC وأعد تعليق الخلايا جيدا. احتفظ بمقدار 10 ميكرولتر لحساب الخلايا.
    4. قم بتكسير الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 200 × جم عند 20-25 درجة مئوية. عد الخلايا واحسب الحجم المطلوب لتحقيق كثافة مناسبة من hiPSCs (75-400 × 103 لكل بئر) في صفيحة 12 بئرا مغلفة بغشاء القاعدي (الخطوة 1.1.1).
    5. قم بشفط محلول الطلاء من الآبار وأضف 1 مل من وسط hiPSC الذي يحتوي على 10 ميكرومتر مثبط ROCK في كل بئر (1: 1,000 تخفيف). بعد الطرد المركزي ، قم بشفط المادة الطافية وفصل الحبيبات في 1 مل من وسط hiPSC.
    6. أضف الحجم المطلوب من hiPSC، المحدد في الخطوة 1.2.4، إلى كل بئر من الصفيحة المكونة من 12 بئرا. قد تكون لواحان إلى أربعة ألواح مكونة من 12 بئرا كافية للتمييز بين استنساخ hiPSC. راجع الخطوة 1.2.4 لتحديد عدد الألواح المطلوبة لخلايا البذر.
    7. ضع اللوحة في حاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2). قم بتوزيع الخلايا بالتساوي عن طريق تحريك اللوحة برفق ذهابا وإيابا ثم جنبا إلى جنب في الحاضنة.
    8. في اليوم التالي (أي اليوم -2) ، استبدل الوسط ب 2 مل من وسط صيانة hiPSC الذي يفتقر إلى مثبط ROCK. في اليوم التالي (اليوم -1) ، استبدل الوسيط ب 2 مل من وسط صيانة hiPSC الطازج.
  3. تحريض EPCs مع مثبط سينسيز كيناز الجليكوجين 3 (GSK-3) CHIR99021 (اليوم 0 إلى اليوم 5)
    1. في اليوم 0 ، استبدل وسط صيانة hiPSC في كل بئر ب 2 مل من وسط LaSR الذي يحتوي على 8 ميكرومتر CHIR99021.
    2. في اليوم 1 ، استنشق الوسط وأضف 2 مل من وسط LaSR الطازج الذي يحتوي على 8 ميكرومتر CHIR99021.
    3. في الأيام 2 و 3 و 4 ، استبدل الوسط ب 2 مل من وسط LaSR الطازج الذي يفتقر إلى CHIR99021.
  4. فرز الخلايا المنشطة المغناطيسية (MACS) لتنقية CD31 + EPCs (اليوم 5)
    1. في اليوم 5 ، قم بشفط الوسط ثم أضف 1 مل من كاشف التفكك إلى كل بئر ، قبل الحضانة لمدة 6-8 دقائق عند 37 درجة مئوية.
    2. قم بفصل الخلايا وتفردها باستخدام ماصة دقيقة والمرور عبر مصفاة خلية 40 ميكرومتر لتصفية المعلق في أنبوب سعة 50 مل يحتوي على 10 مل من وسط DMEM / F12-10. قم بتصفية تعليق الخلية الذي تم جمعه من أكثر من لوحين من 12 بئرا إلى أنبوبين سعة 50 مل على الأقل.
    3. أوقف تفاعل الهضم عن طريق إضافة وسط DMEM / F12-10 (حتى 50 مل). الماصة جيدا واحتفظ ب 10 ميكرولتر لعد الخلايا. قم بتكسير الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 200 × جم عند 20-25 درجة مئوية.
    4. بعد إزالة المادة الطافية ، أضف 10 مل من وسط DMEM / F12-10 وانقل تعليق الخلية إلى أنابيب جديدة سعة 15 مل. قم بتكسير الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 200 × جم عند 20-25 درجة مئوية.
    5. استنشق المادة الطافية وأعد تعليقها في المخزن المؤقت للتدفق -1 بكثافة 1.0 × 107 خلايا لكل 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت.
    6. أضف كاشف حجب مستقبلات Fc (FcR) بنسبة 1: 100 واحتضن لمدة 5 دقائق قبل إضافة الجسم المضاد CD31 المسمى بالفلورسين (FITC) المخفف 1: 200. احتضن التعليق لمدة 30 دقيقة في الظلام عند 20-25 درجة مئوية.
    7. أضف 10 مل من المخزن المؤقت للتدفق -1 ، مع الاحتفاظ ب 10 ميكرولتر من المعلق لتحليل قياس التدفق الخلوي لتحديد جزء خلايا CD31 + (الشكل 1).
    8. قم بتكسير الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند 20-25 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليقها إلى كثافة 1.0 × 107 خلايا لكل 100 ميكرولتر من محلول التدفق المؤقت -1. أضف كوكتيل اختيار FITC (5 ميكرولتر لكل 100 ميكرولتر من تعليق الخلية). تخلط جيدا عن طريق سحب العينة وتحتضن في الظلام لمدة 15 دقيقة عند 20-25 درجة مئوية.
    9. أضف 5 ميكرولتر من الجسيمات النانوية المغناطيسية لكل 100 ميكرولتر من تعليق الخلية ، وقم بتسخين الماصة جيدا ، واحتضانها في الظلام لمدة 10 دقائق عند 20-25 درجة مئوية.
    10. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب قياس التدفق الخلوي سعة 5 مل وأضف المخزن المؤقت للتدفق -1 لتحقيق حجم إجمالي يبلغ 2.5 مل. ضع أنبوب قياس التدفق الخلوي في المغناطيس لمدة 5 دقائق.
    11. في حركة مستمرة ، قم بقلب المغناطيس وصب معلق الخلية الذي يحتوي على خلايا لم يتم تصنيفها بالجسم المضاد FITC-CD31. حافظ على المغناطيس والأنبوب في الوضع المقلوب لمدة 2-3 ثوان ثم قم بإزالة السائل المتبقي. استنشق أي قطرات على حافة الأنبوب قبل إعادة الأنبوب إلى وضع رأسي.
    12. التقط أنبوب قياس التدفق الخلوي من المغناطيس وأضف 2.5 مل من المخزن المؤقت للتدفق -1 لغسل خلايا CD31+ المتبقية. أعد تعليق الخلايا عن طريق سحب الخلايا برفق لأعلى ولأسفل مرتين أو ثلاث مرات. ضع أنبوب التدفق في المغناطيس لمدة 5 دقائق.
    13. كرر الخطوات 1.4.11-1.4.12 ثلاث مرات ثم الخطوة 1.4.11 مرة أخرى ليصبح المجموع أربع غسلات.
    14. قم بإزالة أنبوب التدفق من المغناطيس وأضف الكمية المحددة من الوسط المناسب (على سبيل المثال ، وسط خال من مصل البطان البطاني البشري [hECSR] لثقافة EC الممتدة أو وسط التجميد للتجميد) إلى الأنبوب لإعادة تعليق خلايا CD31 + المنقاة. احتفظ بحصتين 10 ميكرولتر من المعلق ، أحدهما لعد الخلايا والثاني لإجراء تحليل قياس التدفق الخلوي لتقييم نقاء خلايا CD31 + في عينات ما بعد MACS (الشكل 1). إذا لم يكن مقياس التدفق الخلوي متاحا على الفور ، فقم بتخزين الكمية عند 4 درجات مئوية حتى التحليل.
    15. قم بتجميد CD31 + EPCs في هذه المرحلة.
      ملاحظه: يمكن استخدام الألواح ذات 12 البئر المطلية بالفيترونكتين ووسط صيانة hiPSC الأكثر استقرارا (mTeSR plus) بدلا من الألواح المطلية بالمصفوفة الغشائية القاعدية ووسط صيانة hiPSC (mTeSR1). لتحضير ألواح 12 بئرا مطلية بفيتامين ، قم بتخفيف الفيترونكتين بمحلول التخفيف إلى تركيز نهائي قدره 10 ميكروغرام / مل ثم انقل 500 ميكرولتر من المحلول المخفف إلى كل بئر من الألواح المكونة من 12 بئرا. اترك الألواح عند 20-25 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل. كثافة البذر ل hiPSCs المفردة قابلة للمقارنة مع تلك المستخدمة في الألواح المطلية بمصفوفة الغشاء القاعدي. قد يؤثر تغيير وسط الاستزراع أو تكوين المصفوفة على التكاثر والتمايز التلقائي لمركبات الكثافة العليا ، والتي تتطلب عادة 1-2 أسابيع للتكيف مع ظروف الاستزراع الجديدة. إذا تم استخدام وسيط صيانة hiPSC الأكثر استقرارا لصيانة hiPSC ، فيمكن استخدام هذا الوسيط لتمييز EPC بدلا من وسيط صيانة hiPSC. في هذه الحالة ، يجب تغيير وسيط صيانة hiPSC الأكثر استقرارا في اليوم -2 لإزالة مثبط ROCK ، ويمكن تخطي التبادل في اليوم -1.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجدول 1: تفاصيل الكواشف المحددة للمقايسات. يتم وصف الاسم والكمية الدقيقة للمكونات لكل كاشف محدد.

كاشف محدد العنصر حجم حمض الخليك ، محلول 0.5 مجم / مل حمض الخليك 119 ميكرولتر ماء ، معقم ، زراعة الخلايا 250 م...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مرشح حقنة 0.22 مم برنامج النقاط التجارية 99722 أنبوب الطرد المركزي 15 مل صقر 352196 مصفاة خلايا فالكون 40 ميكرومتر صقر هاتف: 352340 5 مل أنبوب دائري القاع الاسكتلندي 40005 50 مل أنبوب الطرد المركزي صقر 352070 96-لوحة جيدة ، قاع دائري الاسكتلندي 34096 أكوتاز سيجما ألدريتش A6964-500 مل حمض الخليك سيجما ألدريتش 695092 DMEM / F12 المتقدم تقنيات الحياة هاتف 12634 مجهر مضان الكل في واحد كينس BZ-X810 مكمل B-27 (503) ، خال من المصل ثيرمو فيشر العلمي 17504044 ألبومين مصل الأبقار (BSA) ، 7.5٪ في dPBS سيجما ألدريتش أ 8412 CellAdhere التخفيف العازلة تقنيات STEMCELL ST-07183 CHIR99021 سيليك للكيماويات S1263 الكولاجين الوريدي من المشيمة البشرية سيجما ألدريتش ج 5533 ألواح زراعة أنسجة كورنينج (12 بئر) كورنينج 3512 ريال ألواح زراعة أنسجة كورنينج (6 آبار) كورنينج 3506 [م] أنبوب التبريد الداخلي 2.0 مل واتسون 1396-201 ق ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ، معقم سيجما ألدريتش د2650 DMEM (13) ، [+] 4.5 جم / لتر D-glucose ، [-] L-glutamine ، [-] البيروفات ثيرمو فيشر العلمي 31053-028 Dulbecco's (د) PBS (بدون الكالسيوم والمغنيسيوم) ثيرمو فيشر 14190250 خليط النسر المتوسط / المغذي المعدل F-12 من Dulbecco (DMEM-F12) ثيرمو فيشر العلمي 11320074 مجموعة الاختيار الإيجابي EasySepFITC II تقنيات STEMCELL 18558 إيزي سيب ماغناطيس تقنيات الخلايا الجذعية 18000 محلول حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك 0.02٪ في DPBS سيغما E8008-100 مل مصل الأبقار الجنيني ، مؤهل ثيرمو فيشر العلمي 10270106 محلول عازلة HEPES ثيرمو فيشر العلمي هاتف: 15630-056 وسط خال من مصل البطان البشري (hESFM) ثيرمو فيشر العلمي هاتف: 11111-044 عامل نمو الخلايا الليفية البشرية 2 (FGF2) توكرس 233-FB-500 الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان iPS ريكن آر بي سي HPS1006 كبريتات كاناميسين (100x) ثيرمو فيشر العلمي 15160-047 حمض الأسكوربيك 2-فوسفات سيسكوي مغنيسيوم ملح هيدرات سيجما ألدريتش أ 8960-5 جي ل-جلوتامين 200 ملم (1003) ثيرمو فيشر العلمي 25030-024 Matrigel ، انخفاض عامل النمو كورنينج 354230 ميم نيا (1003) ثيرمو فيشر العلمي 11140-035 مثبط الصخور Y-27632 توكرس 1254 قاعدة RPMI متوسطة 1640 تريس سيجما ألدريتش 93362 تريتون X-100 سيجما ألدريتش X100

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CD31 Positive CellsEndothelial Progenitor CellsMagnetic Activated Cell SortingFluorophore Conjugated AntibodyPolymer Coated Magnetic NanoparticlesFlow Cytometry AnalysisCell Surface MarkerCell Isolation TechniqueStem Cell DifferentiationCell Purification Method

مقالات ذات صلة