تمييز الخلايا الجذعية العصبية البشرية إلى أسلاف عصبية وخلايا نجمية

الملخص

المصدر: McGrath, E.L., et al. عدوى فيروس زيكا للخلايا الجذعية العصبية لدماغ الجنين البشري المزروع للتحليل الكيميائي المناعي. J. Vis. Exp. (2018).

يوضح هذا الفيديو طريقة تمييز الخلايا الجذعية العصبية البشرية من المجالات العصبية إلى أسلاف عصبية وخلايا نجمية باستخدام العلاج الأنزيمي والزراعة في وسط غني بعامل النمو ، مما يؤدي في النهاية إلى النضج إلى خلايا سلفية متخصصة.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

< p class = "jove_title" >1. تحضير وسط المخزون واستعادة الخلايا الجذعية

1. قم بإعداد مخزون متوسط الاستزراع (DFHGPS) من خلال الجمع بين الكواشف في الخطوات 1.1.1.-1.1.5.
   1. أضف 210 مل من وسط النسر المعدل من Dulbecco مع نسبة عالية من الجلوكوز و L-glutamine (D). قم بتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
   2. أضف 70 مل من مزيج المغذيات F12 من لحم الخنزير مع مكمل L-glutamine (F). قم بتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
   3. أضف 4.2 مل من 15 ملي مولار HEPES Buffer (H) وقم بتخزينه في درجة حرارة الغرفة.
   4. أضف 4.2 مل من محلول D-glucose 10٪ (G) وقم بتخزينه في درجة حرارة الغرفة.
   5. أضف 2.88 مل من محلول البنسلين / الستربتومايسين (PS). قم بنقل محلول المرق إلى 3 مل من الحصص وقم بتخزين الحصص عند -20 درجة مئوية لحين الحاجة.
      ملاحظه: سيكون التركيز النهائي للبنسلين في الوسط 100 وحدة / مل ، وسيكون تركيز الستربتومايسين 100 ميكروغرام / مل. سيشار إلى هذه الوسيلة باسم DFHGPS لبقية البروتوكول ويجب تخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية للاستخدام في غضون 1-2 أسابيع. إذا لزم الأمر ، يمكن توسيع نطاق DFHGPS بشكل متناسب.
2. في اليوم السابق لاستعادة الخلايا ، قم بتغطية قارورة T75 ب 5 مل من الوسط المكيف الذي تم الحصول عليه من الثقافات السابقة لخط خلايا hNSC واتركها في حاضنة 37 درجة مئوية مع 8.5٪ ثاني أكسيد الكربون (CO₂) بين عشية وضحاها.
   ملاحظه: إذا كنت تزرع حاليا الخلايا السرطانية السرطانية ، فاحفظ الوسط الذي تنمو فيه الخلايا أثناء التغيير المتوسط. هذا وسيط مكيف لأنه "مكيف" بواسطة الخلايا. يمكن حفظ الوسط المكيف في أنبوب غطاء لولبي وتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة 7 أيام تقريبا. اتصل بالمؤلف المراسل لتلقي hNSCs. يفضل الوسط المكيف ولكنه ليس مطلوبا تماما ، خاصة عند بدء ثقافة hNSCs لأول مرة.
3. في يوم التعافي ، قم بتسخين 20 مل من DFHGPS في أنبوب غطاء لولبي سعة 50 مل في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق على الأقل واحتفظ به في الحمام المائي حتى يصبح جاهزا للاستخدام.
4. في أنبوب غطاء لولبي منفصل سعة 15 مل ، قم بتسخين 10 مل من DFHGPS في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق على الأقل واحتفظ به في الحمام المائي حتى يصبح جاهزا للاستخدام في الخطوة 1.13.
5. استرجع وعاء من الثلج وجميع المكونات المتوسطة (الجدول 1). قم بإذابة جميع المكونات المتوسطة على الجليد واتركها على الجليد أثناء التحضير للتغيير المتوسط.
6. احصل على 5 مل من المرق المتوسط المكيف (مخزن في 4 درجات مئوية) واحتفظ به في حمام مائي 37 درجة مئوية حتى يصبح جاهزا للاستخدام في الخطوة 1.14. انظر الملاحظة بعد الخطوة 1.2 إذا لم يكن هناك وسط مشروط أو مزرعة الخلايا الجذعية العصبية للجنين البشري الحالية.
7. استرجع أنبوب الغطاء اللولبي سعة 50 مل من الخطوة 1.3 وضعه في خزانة السلامة الحيوية (BSC). انقل 10 مل من DFHGPS إلى أنبوب غطاء لولبي جديد سعة 15 مل ، ثم ضع الأنبوب سعة 50 مل الذي يحتوي على 10 مل المتبقية من وسط DFHGPS في الحمام المائي 37 درجة مئوية.
8. احصل على قارورة تبريد من hNSCs المخزنة في النيتروجين السائل. انظر الملاحظة بعد الخطوة 1.2 إذا لم تكن هناك زراعة الخلايا الجذعية العصبية للجنين البشري حاليا.
   ملاحظه: تم اشتقاق الخلايا الجذعية العصبية البشرية في الأصل من أدمغة الجنين البشري المهملة12 وتم الحفاظ عليها في الثقافة دون تعديلات جينية10. يجب إذابة 5 × 10⁶ خلايا وطلاءها على قارورة T75. يجب أن تحتوي كل قارورة تبريد على 5 × 10⁶ خلايا. لذلك ، هناك حاجة إلى قارورة واحدة لكل قارورة.
9. قم بإذابة قارورة من الخلايا في حمام مائي 37 درجة مئوية عن طريق قلب القارورة كل 10 ثوان لمدة دقيقة واحدة تقريبا أو حتى يذوب الجليد وتصبح محتويات القارورة سائلة تماما. لا تغمر القارورة بأكملها تحت الماء لتجنب التلوث المحتمل.
10. في BSC ، استخدم ماصة دقيقة P1000 لشفط محلول الخلية المذابة وإضافته إلى الأنبوب سعة 15 مل من الخطوة 1.7 ، والذي يحتوي على 10 مل من DFHGPS. لإضافة محلول الخلية المذابة من حيث الانخفاض ، اضغط ببطء على المكبس بحيث يتم إطلاق قطرة أو قطرتين فقط في وقت واحد. في هذه الأثناء ، قم بتدوير الأنبوب سعة 15 مل للسماح بمزيج سريع.
11. جهاز الطرد المركزي لتعليق الخلية عند 200 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية ، مع التأكد من الاحتفاظ بحبيبات الخلية.
12. خلال الخطوة 1.11 ، استرجع الأنبوب سعة 50 مل الذي يحتوي على 10 مل المتبقية من الخطوة 1.7. بعد الطرد المركزي ، أعد تعليق حبيبات الخلية في 10 مل DFHGPS وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى عند 200 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
13. أثناء الدوران النهائي ، قم بإعداد وسط النمو الجديد باتباع الجدول 1 لإضافة عوامل النمو إلى 10 مل من وسط DFHGPS من الخطوة 1.4 (الجدول 1) في BSC. اترك الوسط الجديد الذي يحتوي على عوامل النمو في BSC حتى يصبح جاهزا للاستخدام.
14. استرجع قارورة T75 من الخطوة 1.2 وتخلص من الوسط المكيف الذي يغلي القارورة عن طريق الشفط. ثم أضف 5 مل من الوسائط المكيفة من الخطوة 1.6. إلى القارورة باستخدام ماصة مصلية. احرص على عدم خدش الجزء السفلي من القارورة.
15. استرجع أنبوب الخلايا من جهاز الطرد المركزي وتخلص من المادة الطافية عن طريق شفطه ، وترك حبيبات الخلية سليمة.
16. أعد تعليق حبيبات الخلية في 10 مل من الوسائط الجديدة من الخطوة 1.13 باستخدام ماصة مصلية سعة 5 مل وسحب العينة لأعلى ولأسفل عدة مرات. أضف التعليق إلى قارورة T75 المطلية من الخطوة 1.14. استخدم الكمية المتبقية 5 مل لشطف الأنبوب الذي يحتوي على حبيبات الخلية ، ثم أضف تلك 5 مل إلى القارورة أيضا.
17. هز قارورة T75 ذهابا وإيابا 3 مرات لضمان توزيع الخلايا بالتساوي عبر القارورة. تأكد من أن غطاء القارورة مفكوك للسماح بتدفق الهواء. تحت المجهر الضوئي ، راقب الخلايا ، وقم بتدوين الملاحظات ، والتقط الصور إن أمكن.
    ملاحظه: يجب أن تبدو الخلايا شفافة وكروية. قم بتدوين ملاحظة إذا كانت هناك خلايا تبدو مظلمة أو معتمة أو ذات حدود غير متماثلة ، حيث يمكن أن يشير ذلك إلى موت الخلايا. راقب أيضا أي تلوث فطري أو بكتيري ، مثل أن تصبح الوسائط صفراء اللون.
18. ضع قارورة الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية مع 8.5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
    ملاحظه: استخدم 8.5٪ بدلا من 5.0٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2} للحفاظ على درجة الحموضة في وسط الثقافة الخالية من المصل في حدود 7.1-7.4.

< p class = "jove_title" >2. hNSC التغيير المتوسط

ملاحظة: قم بتغيير الوسيط كل 3-4 أيام.

1. قم بتشغيل BSC ونظفه جيدا باستخدام 70٪ من الإيثانول. راقب الخلايا تحت المجهر الضوئي.
   ملاحظه: قم بتدوين ملاحظات حول مظهر الخلايا وأحجام الكرات. بعد ثلاثة أيام من التعافي أو المرور ، ستتجمع الخلايا معا وتبدأ في تكوين مجالات عصبية غير ملتصقة.
   أنذر: إذا التصقت الخلايا بالجزء السفلي من القارورة ، فستحتاج إلى التخلص من الثقافة لأن التصاق الخلية سيزيد من التمايز المبكر ، ولن تتمكن الخلايا من الحفاظ على الحالة الجذعية. إذا كان هناك عدد كبير جدا من الخلايا في القارورة ، فقد تشكل الخلايا كرات كبيرة (أكبر من 2 مم في القطر) ، وفي هذه الحالة ، ستبدأ الخلايا الموجودة في وسط الكرة في التمايز بسبب عدم الوصول إلى عوامل النمو في الوسط. إذا لوحظت كرات يزيد قطرها عن 1 مم ، فيمكن مرور الخلايا (الخطوات 3.1-3.22).
2. اتبع الخطوتين 1.4 و 1.5 ، وقم بإعداد 10 مل من الوسط الطازج (انظر الخطوة 1.13).
3. قم بإمالة القارورة إلى الجانب ، مما يسمح للكرات بالغرق في قاع القارورة.
4. قم بإزالة 5 مل من الوسائط المكيفة من أعلى الوسط المجمع باستخدام ماصة مصلية سعة 5 مل ، مع الحرص على عدم شفط أي مجالات عصبية. ضع 5 مل من الوسائط المكيفة في أنبوب نظيف سعة 15 مل.
5. قم بإزالة 5 مل إضافية من الوسائط المكيفة من القارورة ، وتجنب الكرات بعناية مرة أخرى ، وضع 5 مل في نفس الأنبوب سعة 15 مل.
6. أضف 10 مل من الوسائط الجديدة من الخطوة 2.2 إلى 5 مل المتبقية من الوسائط والخلايا المكيفة في القارورة. ضع القارورة بشكل مسطح وراقب الخلايا تحت المجهر الضوئي.
7. إذا بدا أن الخلايا قد تم استنشاقها أثناء جمع الوسط المكيف ، فقم بتدوير الوسط المكيف عند 100 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أعد تعليق أي خلايا تتراكم في الأسفل في 1 مل من الوسط المكيف ، ثم أضفها إلى قارورة الثقافة.
8. قم بتخزين 10 مل من الوسائط المكيفة غير المستخدمة من الخطوات 2.5 / 2.6 عند 4 درجات مئوية في أنبوب غطاء لولبي سعة 15 مل.
9. كرر الخطوات 1.17 / 1.18.

< p class = "jove_title" >3. hNSC Passage

1. في حالة توسيع NSCs إلى قارورة جديدة ، تأكد من طلاء جميع القوارير الجديدة كما في الخطوة 1.2.
2. قم بتنظيف BSC كما في الخطوة 2.1، وقم بتنفيذ الخطوتين 1.4 و 1.5.
3. تحضير الوسط كما في الخطوة 1.13. تتطلب كل قارورة T75 10 مل من المتوسطة. بالنسبة لقوارير T75 المتعددة ، اضرب 10 مل من الوسائط في عدد القوارير.
4. قم بإعداد 1 أو 3 مل من محلول ملحي Dulbecco المخزن بالفوسفات (dPBS) والجلوكوز وضعه في حمام مائي 37 درجة مئوية للتدفئة لمدة 10 دقائق (لمحلول التربسين) وفقا للأحجام الواردة في الجدول 2. لا تضيف التربسين أو DNase في الوقت الحالي. قد تكون هناك حاجة إلى DNase لتحطيم أي حمض نووي يتم إطلاقه من الخلايا الميتة بسبب تفكك الخلايا الميكانيكية أو الكيميائية.
   ملاحظة: بالنسبة لقارورة T75 واحدة يتم تمريرها بعد 9-10 أيام من النمو ، سيكون هناك ما يقرب من 30 × 10⁶ خلايا إذا تم زرع 5 × 10⁶ في الأصل على القارورة. عادة ، يتم استخدام 1 مل من محلول dPBS ل 10 × 10⁶ خلايا. لذلك ، هناك حاجة إلى 3 مل من محلول dPBS لقارورة T75 التي تمر بعد 9-10 أيام.
5. ضع قاربا صغيرا نظيفا ومقياس كثافة الدم في الغطاء. نظف ب 70٪ من الإيثانول واتركه يجف في الهواء في الشفاط لمدة 5 دقائق تقريبا.< / > ملاحظه: سيتم استخدام قارب الوزن في الخطوات 3.17.1.
6. استرجع قارورة الخلايا التي سيتم تمريرها من الحاضنة وإحضارها إلى BSC. قم بإمالة القارورة برفق للسماح للخلايا بالغرق في قاع الوسائط المجمعة. يوجد حوالي 15 مل من الوسائط في القارورة.
7. قم بإزالة حوالي 10 مل من الوسائط في أجزاء سعة 5 مل (أي 5 مل + 5 مل). ضع 10 مل من الوسائط في أنبوب نظيف سعة 15 مل يسمى "CM" ل "الوسط المكيف". احرص على عدم شفط أي من الخلايا المستقرة في 5 مل المتبقية من الوسائط في القارورة ؛ ستخضع هذه الخلايا و 5 مل من الوسائط للخطوة 3.8.
   1. خذ 3 مل من الوسائط المكيفة من أنبوب "CM" (من الخطوة 3.7) وضعها في أنبوب سعة 15 مل يسمى "محلول مثبط التربسين". سيتم استخدام هذا في الخطوة 3.12. بعد إزالة 3 مل ، يتبقى 7 مل من الوسائط المكيفة في أنبوب "CM". ضع الأنبوب "CM" جانبا حتى الخطوة 3.9.
8. قم بإزالة 5 مل من الوسائط والخلايا المتبقية في قارورة T75 وضعها في أنبوب نظيف سعة 15 مل يسمى "الخلايا".
9. خذ الأنبوب "CM" الذي يحتوي على 7 مل من الوسائط المكيفة (من الخطوة 3.7.1) واشطف الجزء السفلي من قارورة T75 مرتين بأجزاء 3.5 مل من الوسائط المكيفة باستخدام ماصة مصلية سعة 5 مل. بعد كل شطف ، ضع الأجزاء 3.5 مل في أنبوب "الخلايا". الغرض من هذه الخطوة هو إزالة جميع المجالات العصبية (الخلايا) من قارورة T75.
10. جهاز الطرد المركزي أنبوب "الخلايا" عند 100 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أثناء دوران الخلايا ، احصل على محلول dPBS / الجلوكوز من حمام مائي 37 درجة مئوية وأضف الكمية المناسبة من التربسين و DNase وفقا للجدول 2.
11. بعد توقف أنبوب "الخلايا" عن الدوران ، قم بإزالة كل المادة الطافية المتوسطة المكيفة ونقلها إلى أنبوب "CM".
12. خذ الأنبوب المسمى "محلول مثبط التربسين" من الخطوة 3.7.1. وأضف حجم مثبط التربسين الموضح في الجدول 3. استخدم نفس حجم محلول مثبط التربسين كما تم استخدامه لمحلول التربسين.
13. ضع محلول مثبط التربسين في حمام مائي 37 درجة مئوية لحين الحاجة.
14. أضف محلول التربسين إلى حبيبات الخلية في أنبوب سعة 15 مل وقم برفع وهبوط الماصة لأعلى ولأسفل حوالي 5-10 مرات باستخدام ماصة سعة 5 مل. أغلق غطاء الأنبوب واحتضنه في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. بعد 5 دقائق ، استرجع الخلايا والماصة لأعلى ولأسفل 5-10 مرات. ثم احتضن في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة إضافية.
15. في آخر 5 دقائق ، انقل محلول مثبط التربسين إلى BSC.
16. استرجع الخلايا بعد اكتمال الخطوة 2.14 وقم بسحب الخلايا لأعلى ولأسفل حتى يتم فصل الكرات تماما (20-30 مرة). بعد ذلك ، أضف محلول مثبط التربسين على الفور والماصة لأعلى ولأسفل 10 مرات. سيشار إلى هذا المحلول من الخلايا المنفصلة ومثبط التربسين باسم "تعليق الخلية".
17. احسب عدد الخلايا في تعليق الخلية باتباع الخطوات.
    1. ماصة 15 ميكرولتر من خليط التربان الأزرق المسبق (تحتوي على 5 ميكرولتر من 0.4٪ Trypan Blue و 10 ميكرولتر من dPBS) على قارب وزن صغير ، ثم أضف 5 ميكرولتر من تعليق الخلية. ماصة لأعلى ولأسفل 3-5 مرات للخلط. بعد ذلك، ضع ماصة 10 ميكرولتر من معلق Trypan Blue/cell على جانبي مقياس الدم المغطى بغطاء زجاجي.
    2. راقب الخلايا تحت المجهر الضوئي واحسب العدد الإجمالي للخلايا في كل شبكة من شبكات الزوايا الأربع. اجمع هذه الأرقام معا.
18. كرر العد للجانب الآخر ومتوسط الجانبين معا.
19. اضرب هذا الرقم في 10,000 لإعطاء العدد الإجمالي للخلايا لكل مل. اضرب هذا الرقم في العدد الإجمالي للملليلتر لحساب العدد الإجمالي للخلايا في معلق الخلية. احسب مقدار حجم تعليق الخلية المطلوب لزرع 5 ملايين خلية لكل قارورة T75.
    ملاحظه: عادة ، بعد 9-10 أيام ، سيحتوي T75 على 25-30 × 106 خلية. لذلك ، في حالة تمرير جميع الخلايا إلى قوارير جديدة ، هناك حاجة إلى ما مجموعه 5-6 قوارير.
20. أضف حجم تعليق الخلية المحسوب في الخطوة 3.19 إلى كل قارورة T75 للحصول على 5 × 10⁶ خلايا لكل قارورة. إذا كان الحجم أقل من 5 مل ، فأضف وسيطا إضافيا لتكوين ما يصل إلى 5 مل. ثم أضف 10 مل من وسائط DFHGFPS الجديدة التي تحتوي على عوامل النمو (الجدول 1) إلى القارورة.
21. كرر الخطوتين 1.17 و 1.18 وتأكد من تسمية القارورة بنوع الخلايا والتواريخ وعدد الخلايا في القارورة ورقم المرور (هذا هو عدد المرات التي تم فيها تمرير الخلية). ثم انتقل إلى الخطوة 4.
22. إذا لزم الأمر ، قم بزرع خلايا إضافية في قارورة T75 واحدة بكثافة تصل إلى 30 × 10⁶ خلايا لكل قارورة طوال الليل وقم بتجميدها في اليوم التالي وفقا للخطوة 4.

4. hNSC التجميد والتخزين

1. في اليوم التالي للمرور ، استرجع القارورة من الحاضنة التي تحتوي على الخلايا للتجميد (من الخطوتين 3.19 و 3.22). قم بإمالة القارورة وإزالة جميع الوسائط والخلايا من القارورة ، وضعها في أنبوب سعة 15 مل. ثم ، قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 216 × جم لمدة 5 دقائق.
2. أثناء عملية الطرد المركزي ، قم بإعداد وسط التجميد (الجدول 4). لكل 5 × 10⁶ خلايا ، قم بإعداد 1 مل من وسط التجميد. تم تحديد عدد الخلايا في الخطوة 3.19 عند تحديد عدد الخلايا التي يجب وضعها في كل قارورة. لن يتغير هذا الرقم بين عشية وضحاها.
3. قم بإعداد قوارير حفظ بالتبريد مع ملصقات اسم الخلية ورقم المرور ورقم الخلية والأحرف الأولى والتاريخ. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الطافية عن طريق الشفط وأعد تعليق حبيبات الخلية في وسط التجميد بحيث يكون هناك 5 × 10⁶ خلايا / مل. باستخدام ماصة سعة 5 مل ، قم بتناول 1 مل لكل قارورة وأغلقها بإحكام (5 × 10⁶ خلايا لكل قارورة).
4. ضع القوارير في وعاء محفوظ بالتبريد يحتوي على 250 مل من الأيزوبروبانول (الحد الأقصى للاستخدام هو 5 مرات لكل بديل من الأيزوبروبانول). يحفظ في فريزر -80 درجة مئوية طوال الليل ، ثم ينقل إلى نظام تخزين خزان النيتروجين السائل.

5. الطلاء hNSC الملتزم للتحقق

من الصحة

1. في اليوم السابق للمرور (الخطوات 3.1-3.22) ، قم بتنظيف BSC كما في الخطوة 2.2 واحصل على صفيحة 24 بئرا وأغطية زجاجية معقمة مقاس 12 مم.
2. باستخدام الملقط ، ضع غطاء واحد في قاع كل بئر من اللوحة.
3. قم بتغطية الآبار التي تحتوي على أغطية ب 0.01٪ بولي د-ليسين (PDL) في ماء معقم واحتضانها لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. بالنسبة للوحة 24 بئرا ، استخدم 250 ميكرولتر من PDL لكل بئر.
4. قم بإزالة PDL من الآبار ، ثم قم بتغطيته ب 1 ميكروغرام / سم 2 لامينين / ديسيبل في الثانية (250 ميكرولتر لكل بئر). احتضان الطبق طوال الليل عند 37 درجة مئوية. إذا لم تكن هناك حاجة في اليوم التالي ، فقم بإغلاق اللوحة بالبارافيلم عن طريق لف البارافيلم حول حواف اللوحة وتخزينها عند 4 درجات مئوية
   ملاحظه: يمكن تخزين الألواح المطلية باللون اللامينين لمدة تصل إلى أسبوعين إذا كانت مختومة بالبارافيلم طالما أن الأغطية لا تجف.
5. خلايا المرور كما هو موضح في الخطوات 3.1-3.22 ، ثم تحديد عدد الخلايا التي يجب زرعها في الصفيحة المكونة من 24 بئرا مع أغطية مغلفة.
6. قم بإزالة أي محلول لامينين زائد من الآبار من خلال الشفط ، واشطفه مرة واحدة باستخدام 0.5 مل من dPBS. ثم ، قم بزرع الخلايا في الآبار بكثافة 0.6-1 × 10⁵ خلايا / سم² لكل بئر. استخدم أي خلايا متبقية وفقا للخطوات 3.16-3.21.
7. في أوقات مختلفة أثناء زراعة الألواح المكونة من 24 بئرا ، قم بإصلاح الخلايا وصخها لعلامات الخلايا الجذعية المختلفة.

النتائج

الجدول 1: عوامل النمو لوسط الانتشار الجديد.

وسائط DFHGPS لواحد T75 10 مل TPPS* 173 ميكرولتر 200 ملي ل-جلوتامين 50 ميكرولتر 10 ملغم/مل أنسولين** 25 ميكرولتر

المواد