توليد عضيات دماغية من النوع الأمامي من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان

الملخص

المصدر: Krefft، O. et al.، توليد من العضيات الدماغية الموحدة والقابلة للتكرار من النوع الأمامي من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة عن طريق الإنسان. J. Vis. Exp. (2018).

يوضح هذا الفيديو إنشاء عضيات من نوع الدماغ الأمامي من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة البشرية (iPSCs) ، مما يدل على التقدم من مجاميع الخلايا الجذعية إلى الهياكل المعقدة التي تحاكي قشرة الدماغ وتتمايز إلى أنواع مختلفة من الخلايا العصبية.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. توليد مجاميع iPSC

1. توليد مزارع أحادية الخلية أحادية الخلية من مستعمرات iPSC
   1. قم بإعداد صفيحة 6 آبار مطلية بمستخلص الغشاء القاعدي (BME). قم بإذابة BME على الجليد عند 4 درجات مئوية لمدة 2-3 ساعات ، وقم بتخفيفه باستخدام Dulbecco's Modified Eagle Medium F12 البارد (DMEM-F12 ؛ تخفيف 1:50) ، وقم بتغطية اللوحة ب 1 مل / بئر من محلول BME المخفف ، وقم بتخزين اللوحة طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
   2. شفط الوسط وغسل مستعمرات iPSC سليمة من بئرين على الأقل من لوحة 6 آبار مع 0.5 ملي EDTA في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) مرتين قبل احتضان المستعمرات مع 0.5 ملي مولار حمض إيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) في PBS لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). قم بشفط محلول EDTA وافصل المستعمرات برفق عن طريق غسلها من قاع الطبق ب 5 مل من وسط DMEM-F12. اجمعها في أنبوب سعة 15 مل وقم بتكبيبها عن طريق الطرد المركزي (4 دقائق عند 1,200 × جم عند RT).
      ملاحظة: تم استخدام iPSCs المعاد برمجتها من الخلايا الليفية المتاحة تجاريا بنجاح.
   3. شفط طافي واحتضان مستعمرات iPSC مع 500 ميكرولتر من كاشف تفكك الخلية ل 6 دقائق عند 37 درجة مئوية.
   قم
   4. بسحب معلق الخلية عدة مرات برفق لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة سعة 1 مل لتقسيم مجموعات الخلايا المتبقية إلى خلايا مفردة.
   5. أضف 4 مل من DMEM-F12 إلى تعليق الخلية لتخفيف كاشف تفكك الخلية.
   6. قم بتدوير الخلايا لأسفل عند 1,200 × جم لمدة 4 دقائق في RT.
   7. أعد تعليق الخلايا في 2 مل من وسط iPSC مكمل ب 5 ميكرومتر Y-27632 وخلايا البذور في بئر واحد من لوحة 6 آبار مطلية ب BME.
      ملاحظه: استخدم وسيط iPSC المحدد في جدول المواد لثقافات iPSC أحادية الخلية أحادية الخلية.
   8. في اليوم التالي, استبدال الوسط مع وسيط iPSC جديدة تفتقر إلى Y-27632. من هذه النقطة, استمر في زراعة الخلايا, تغيير الوسط كل يوم حتى iPSCs تكون 100٪ ملتقية. اعتمادا على خط الخلية والتقاء آبار البداية ، سيستغرق ذلك ما بين 2-4 أيام.
   9. بمجرد التقاء ، قم بتمرير iPSCs. شفط وسط وتطبيق 500 ميكرولتر من كاشف تفكك الخلايا على الخلايا.
   10. احتضان الخلايا لمدة 5-10 دقائق عند 37 درجة مئوية. هز اللوحة برفق لفصل الخلايا.
   11. اغسل الخلايا من البئر باستخدام 2 مل من DMEM-F12 واجمعها في أنبوب سعة 15 مل. أضف DMEM-F12 لحجم إجمالي قدره 5 مل.
   12. قم بتدوير الخلايا عند 1,200 × جم لمدة 4 دقائق في RT وشفط المادة الطافية.
   13. بذر الخلايا في وسط iPSC مكمل مع 5 ميكرومتر Y-27632 في 1:2 إلى 1:4 نسبة على لوحة 6 آبار المغلفة BME (2 مل/بئر متوسط).
   14. استمر في زراعة الخلايا لمدة 2-5 أيام وتغيير وسيط iPSC الذي يفتقر إلى Y-27632 كل يوم. مرة واحدة التقاء, تمرير iPSCs (الخطوات 1.1.4-1.1.8).
       ملاحظه: ثقافة iPSCs على الأقل 2 مقاطع كطبقة واحدة في وسيط iPSC المحدد في جدول المواد قبل استخدامها لتوليد مجاميع iPSC للسماح للخلايا بالتكيف مع ظروف الثقافة.
2. استخدام ثقافات iPSC أحادية الطبقة عندما تكون 70-90٪ ملتقى لتوليد مجاميع iPSC.
   ملاحظة: iPSC تتكيف مع ظروف الثقافة حيث أن الخلايا المفردة أقل عرضة للإجهاد الذي يؤدي إلى موت الخلايا أثناء إجراء التفكك والتجميع. تحتاج ثقافات iPSC أحادية الطبقة إلى عرض مورفولوجيا نموذجية متعددة القدرات مع عدم وجود دليل على التمايز. اختبر الثقافات بشكل منتظم بحثا عن تلوث الميكوبلازما. تعمل فقط مع ثقافات iPSC الخالية من الميكوبلازما.
   1. استنشق وسط الثقافة من بئر واحد من صفيحة مكونة من 6 آبار وقم بتطبيق 500 ميكرولتر من كاشف تفكك الخلايا على الخلايا.
   2. احتضان الخلايا لمدة 5-10 دقائق عند 37 درجة مئوية. هز اللوحة برفق لفصل الخلايا.
   3. اغسل الخلايا من البئر باستخدام 2 مل من DMEM-F12 واجمعها في أنبوب سعة 15 مل. أضف DMEM-F12 لحجم إجمالي يبلغ 10 مل.
   4. لعد الخلايا ، خذ 25 ميكرولتر من معلق الخلية واخلطه مع 25 ميكرولتر من التريبان الأزرق لتمييز الخلايا الميتة. عد الخلايا الحية باستخدام غرفة العد.
   5. جمع ما يكفي من الخلايا (4,500 الخلايا لكل ركام iPSC) من تعليق الخلية في 15 أنبوب مل.
   6. قم بتدوير الخلايا عند 1,200 × جم لمدة 4 دقائق في RT وشفط المادة الطافية.
   7. إعادة تعليق الخلايا في حجم مناسب من وسيط iPSC مكمل ب 50 ميكرومتر Y-27632 للحصول على 4,500 خلية حية لكل 150 ميكرولتر.
      ملاحظه: استخدام تركيز عال من Y-27632 (50 ميكرومتر) أمر بالغ الأهمية لبقاء iPSCs.
   8. صفيحة 150 ميكرولتر في كل بئر من صفيحة منخفضة القاع 96 بئرا على شكل حرف U وضعها في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
      ملاحظه: عند توليد مجاميع iPSC, ضع في اعتبارك أن هناك حاجة إلى ما لا يقل عن 6 العضيات لمراقبة الجودة في اليوم 20 (نرى القسم 5).

< p class = "jove_title" >2. تحريض الأديم العصبي الأمامي

1. مراقبة عن كثب التغيرات مورفولوجيا من مجاميع iPSC كل يوم تحت مجهر زراعة الأنسجة باستخدام عدسة 4X أو 10X الطاقة. لاحظ في اليوم 1 ، تتجمع الخلايا بحدود واضحة. الاستمرار في استزراع مجاميع iPSC في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂.
   ملاحظه: عدد معين من الخلايا الميتة / البئر أمر طبيعي ولن يؤثر على توليد العضوية.
2. تغذية مجاميع iPSC بدءا من اليوم 2 وتستمر مع كل يومين عن طريق الشفط برفق تقريبا 2/3 من الوسط دون إزعاج مجاميع الخلية في الأسفل. إضافة إضافية 100 ميكرولتر من وسيط iPSC يفتقر إلى Y-27632.
   ملاحظه: في غضون 4-6 أيام ، سيكون قطر مجاميع الخلية 350-450 ميكرومتر وتظهر حوافا ناعمة.
3. في هذه المرحلة ، قم بتجميع مجاميع الخلية بطرف ماصة مقطوع 100 ميكرولتر في طبق منخفض التعلق 6 سم (بحد أقصى 20 مجاميع / طبق) في وسط تحريض قشري يحتوي على DMEM-F12 مع مكمل N2 (1: 200) ، مكمل B27 (1: 100) ، جلوكوز (0.2 مجم / مل) ، أحادي فوسفات الأدينوزين الدوري (cAMP ؛ 0.15 ميكروغرام / مل) ، 0.5٪ أحماض أمينية غير أساسية (NEAA) ، 1٪ L-alanyl-L-glutamine ، الهيبارين (10 ميكروغرام / مل) ، والمركبات LDN-193189 (180 نانومتر) ، A83-01 (500 نانومتر) ، ومثبط استجابة Wnt -1 (IWR-1) (10 ميكروغرام / مل). قم بتغذية مجاميع الخلايا عن طريق تغيير وسط الحث القشري بعد 3 أيام من نقلها إلى الطبق الذي يبلغ طوله 6 سم.
4. راقب عن كثب التغيرات المورفولوجية أثناء الحث القشري تحت مجهر زراعة الأنسجة باستخدام عدسة طاقة 4X.
   ملاحظه: بعد 4-5 أيام في وسط الحث القشري ، يجب أن تبدأ حواف مجاميع الخلايا في السطوع على السطح ، مما يشير إلى تمايز الأديم العصبي. في هذه المرحلة ، يظهر تنظيم شعاعي للظهارة الكاذبة. انتقل إلى القسم 3 لتضمين مجاميع الخلايا في مصفوفة BME.

فئة

3. تضمين مجاميع الأديم العصبي الظاهر في سقالة مصفوفة

1. قم بإذابة BME على الجليد عند 4 درجات مئوية لمدة 2-3 ساعات.
2. قم بإعداد ورقة فيلم بارافين بلاستيكية لإجراء التضمين. قم بقص فيلم البارافين البلاستيكي باستخدام مقص معقم إلى قطع كبيرة مقاس 4 سم × 4 سم ، ضع قطعة من فيلم البارافين البلاستيكي فوق صينية طرف فارغة سعة 100 ميكرولتر لأطراف 100 ميكرولتر ، واضغط بإصبع مرتديا قفازا بحيث يتم إنشاء غمازات صغيرة في لوح فيلم البارافين البلاستيكي (1 غمازة / خلية مطلوبة). نظف فيلم البارافين البلاستيكي بنسبة 70٪ من الإيثانول وقم بإشعاعه بالأشعة فوق البنفسجية (الطاقة: 15 واط ، الطول الموجي: 435 نانومتر) تحت المقعد المعقم المغلق لمدة 30 دقيقة.
3. انقل كل خلية مجمعة إلى غمازة واحدة من لوح فيلم البارافين البلاستيكي باستخدام طرف مقطوع 100 ميكرولتر بقطر 1.5-2 مم. في حالة دمج مجاميع خليتين ، لا تفصلهما ولكن انقلهما معا إلى غمازة واحدة.
قم
4. بشفط الوسط المحيط بمجاميع الخلايا برفق باستخدام طرف ماصة غير مقطوع سعة 100 ميكرولتر.
   ملاحظه: احرص على عدم امتصاص مجاميع الخلية في الحافة ، لأن ذلك سيؤدي إلى إتلاف الركام.
5. أضف 40 ميكرولتر من BME غير المخفف إلى كل خلية مجمعة.
6. ضع كل ركام خلية في منتصف قطرة BME باستخدام طرف ماصة غير مقطوع سعة 100 ميكرولتر.
   ملاحظه: احرص على عدم الإضرار بالظهارة العصبية النامية بطرف الماصة.
7. انقل ورقة فيلم البارافين البلاستيكية بحذر باستخدام ملقط معقم إلى طبق بتري مقاس 10 سم (أو طبق آخر كاف لزراعة الخلايا) وضع الطبق في الحاضنة لمدة 15-20 دقيقة للسماح ل BME بالتصلب.
8. في هذه الأثناء ، قم بإعداد طبق منخفض التعلق مقاس 6 سم يحتوي على 5 مل من وسط الحث القشري.
9. بعد بلمرة BME ، قم بإزالة القطرات التي تحتوي على مجاميع الخلايا من لوح فيلم البارافين البلاستيكي. باستخدام ملقط معقم ، اقلب طبقة البارافين البلاستيكية واضغط برفق على مجاميع الخلايا في طبق 6 سم منخفض التعلق مائل قليلا (حوالي 30 درجة) حتى تسقط القطرات من لوح فيلم البارافين البلاستيكي. انقل 16 خلية كحد أقصى إلى طبق واحد بحجم 6 سم.
10. استمر في احتضان مجاميع الخلايا عند 37 درجة مئوية.

فئة

4. توليد العضيات من نوع الدماغ الأمامي من مجاميع الأديم العصبي الظاهر

1. بعد يوم واحد من التضمين في مصفوفة BME ، ضع أطباق الثقافة العضوية على شاكر ثقافة الخلايا الهزازة بزاوية إمالة تبلغ 5 درجات و 14 دورة في الدقيقة ، مثبتة في حاضنة زراعة الخلايا.
2. راقب العضيات كل يوم. تتطور الهياكل الشبيهة بالحلقة الظهارية العصبية المتجانسة تدريجيا بعد تضمينها في مصفوفة BME.
3. عندما تكون هياكل الحلقة الظهارية العصبية مرئية ، قم بتغيير وسط التمايز الوسيط إلى وسيط التمايز العضوي الذي يحتوي على DMEM-F12 مع مكمل N2 (1: 200) ، مكمل B27 (1: 100) ، الجلوكوز (0.2 مجم / مل) ، cAMP (0.15 ميكروغرام / مل) ، 0.5٪ NEAA ، 1٪ L-alanyl-L-glutamine ، الأنسولين (2.5 ميكروغرام / مل)
4. استبدل وسط التمايز العضوي كل 3-4 أيام حتى يتم الوصول إلى النقطة الزمنية المطلوبة للتمايز. ثم قم بإصلاح العضيات (انظر القسم 5).
   ملاحظه: في بعض الأحيان ، قد تظهر على الأنسجة براعم من الأنسجة الشفافة بصريا بدون هياكل حلقية. على الرغم من أن هذا ليس مثاليا ، إلا أن هذا لا يؤثر على تطور الهياكل القشرية. يمكن زراعة العضيات في وسط التمايز العضوي لمدة تصل إلى 40 يوما. لفترات الثقافة الممتدة (40-100 يوم) ، يمكن استكمال وسط التمايز العضوي ب 1: 50 BME لزيادة تعقيد الأنسجة ومع BDNF و GDNF للسماح ببقاء الخلايا العصبية ونضجها.

المواد