توليد الخلايا البطانية الدماغية من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات

الملخص

المصدر: Endres، L.M.، et al.، عدوى داء السحايا النايسرية للخلايا البطانية الدماغية المشتقة من الخلايا الجذعية المستحثة. J. Vis. إكسب. (2020)

< p class = "jove_content">يوضح هذا الفيديو بروتوكولا للحث على تمايز الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات إلى خلايا بطانة الدماغ.

البروتوكول

< ص الفئة = "jove_title" >1. إعداد المواد المطلوبة لثقافة iPSC وتمايز BEC.

1. طلاء مصفوفة لبلاستيك زراعة الأنسجة (TC) لثقافة IMR90-4 iPSC
   1. هلام مصفوفة الغشاء القاعدي Aliquot (على سبيل المثال ، Matrigel) في 2.5 مجم من الحصص وتخزينها عند -20 درجة مئوية
      ملاحظه: اعمل بسرعة عند التعامل مع هلام المصفوفة وكمية على الثلج ، حيث يشكل هلاما أعلى من 4 درجات مئوية ولا يمكن تقسيسه بمجرد أن يتصلب.
   2. لطلاء بلاستيك TC ، أضف بسرعة حصة واحدة من هلام المصفوفة إلى 30 مل من وسط النسر المعدل (DMEM) / F12 من Dulbecco في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. أضف 1 مل من الوسط إلى هلام المصفوفة المجمدة، ثم قم برفع وهبوط الماصة حتى تذوب، ثم انقله على الفور إلى الأنبوب المخروطي سعة 50 مل مع الوسط المتبقي.
   3. استخدم 1 مل من محلول طلاء المصفوفة هذا لكل بئر من صفيحة 6 آبار و 12 مل لكل قارورة T75. < / > ملاحظه: يمكن تحضير بلاستيك TC المطلي بالهلام المصفوفة لمدة تصل إلى أسبوعين قبل استخدامه. ومع ذلك ، من الأهمية بمكان تجنب أن يجف محلول هلام المصفوفة ، مما قد يتطلب إضافة المزيد من DMEM / F12 من حين لآخر فوق الآبار.
2. قم بإعداد وسيط صيانة الخلايا الجذعية عن طريق إضافة 50 مل من مكمل 50x إلى 450 مل من الوسط القاعدي لصيانة الخلايا الجذعية في البيئة المعقمة لخزانة السلامة الحيوية.
3. لتحضير 500 مل من الوسط غير المشروط (UM) ، امزج 392.5 مل من DMEM / F12 مع 100 مل من بدائل المصل (KOSR) ، و 5 مل من الأحماض الأمينية غير الأساسية ، و L-glutamine بتركيز نهائي قدره 1 ملي مولار ، و 3.5 ميكرولتر من β-ميركابتو إيثانول. قم بالفلتر والتعقيم وتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
4. لتحضير 200 مل من متوسط الخلايا البطانية (EC) بالإضافة إلى حمض الريتينويك (RA) بالإضافة إلى bFGF ، امزج 198 مل من الوسط الخالي من المصل البطاني البشري (hESFM) ، و 2 مل من المصل المشتق المصل المعقم بالترشيح (PDS) ، و 20 نانوغرام / مل bFGF. قم بتعقيمه وتخزينه لمدة تصل إلى أسبوعين عند 4 درجات مئوية. قبل إضافة الخلايا مباشرة ، أضف 10 ميكرومتر من RA إلى وسط EC.
   ملاحظه: نظرا لأن PDS قد توقف وبالتالي قد يكون محدودا ، فقد تم إجراء هذا البروتوكول بنجاح باستخدام B27 بدلا من PDS.
5. لتحضير 200 مل من وسط EC بدون RA أو bFGF ، امزج 198 مل من hESFM و 2 مل من PDS المعقم بالمرشح وتعقيم المرشح. يحفظ لمدة تصل إلى 4 أسابيع عند 4 درجات مئوية.

< ص فئة = "jove_title">2. تمايز الخلايا البطانية في الدماغ من iPSCs البشرية

1. طلاء iPSCs للتمايز (اليوم -3 من بروتوكول التمايز)
   1. وفقا لثقافة الصيانة IMR90-4 المستخدمة جيدا في اللوحة للتمايز ، واستنشاق وسط الثقافة ، وإضافة 1 مل من كاشف تفكك الخلايا الأنزيمي لكل بئر ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 7 دقائق.
   2. قم بتعطيل كاشف تفكك الخلية الأنزيمية عن طريق نقل 1 مل من تعليق الخلية المنفصلة إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل مع ما لا يقل عن 2 مل من وسط صيانة الخلايا الجذعية الطازجة لكل 1 مل من الخلايا. قم بتدوير تعليق الخلية عند 1,500 × جم لمدة 5 دقائق.
   3. أعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من وسط صيانة الخلايا الجذعية لكل بئر من خلايا IMR90-4 المستخدمة ، وعد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم.
      ملاحظه: قد يكون من المفيد تخفيف 1: 1 مع 0.4٪ تريبان بلو للتمييز بين الخلايا الحية والميتة عند العد. اعتمادا على كثافة iPSCs, عادة ما ينتج عن بئر واحد من لوحة 6 آبار 1-10 6 خلايا.
   4. للتمايز في قارورة T75 ، أضف 7.5 × 10⁵ خلايا إلى 12 مل من وسط صيانة الخلايا الجذعية ومثبط ROCK (Y27632 ثنائي هيدروكلوريد) بتركيز نهائي قدره 10 ميكرومتر. محلول طلاء هلام مصفوفة الشفط من قارورة T75 ونقل تعليق الخلية إلى القارورة. قم بتوزيع الخلايا بالتساوي عن طريق هز القارورة ذهابا وإيابا ومن اليسار إلى اليمين واحتضانها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
      ملاحظه: من الأهمية بمكان إضافة مثبط ROCK في هذه الخطوة لتعزيز بقاء الخلايا الجذعية المفردة المنفصلة. يجب توزيع الخلايا بالتساوي عبر القارورة وفي المفردات التي تظهر مورفولوجيا منتشرة تشبه اللحمة المتوسطة بسبب العلاج بمثبطات ROCK.
2. في اليوم -2 واليوم -1 ، قم بتغيير الوسائط إلى وسيط صيانة الخلايا الجذعية الطازجة ؛ 12 مل لكل T75.
3. في اليوم 0 ، ابدأ التمايز عن طريق تغيير الوسائط إلى UM ؛ 12 مل لكل T75.
4. قم بتغيير UM يوميا (اليوم 1 - اليوم 5).
   ملاحظه: تصل الخلايا عادة إلى التقاء بعد 2 إلى 3 أيام في UM ، والتي يمكن ملاحظتها بالعين المجردة أو من خلال مجهر المجال الساطع المقلوب. مع تقدم التمايز ، تصبح "المسالك العصبية" nestin + مرئية مع خلايا PECAM-1 + بينهما.
5. قم بتوسيع عدد الخلايا البطانية بشكل انتقائي عن طريق التبديل إلى وسط EC مع 20 نانوغرام / مل bFGF و 10 ميكرومتر من حمض الريتينويك (RA) (اليوم 6) والحضانة لمدة يومين. يمكن تحضير وسط EC مع bFGF قبل أسبوعين. يضاف RA من المخزون المجمد في يوم الاستخدام (على سبيل المثال ، 1 ميكرولتر من 10 ملي مولار من مخزون RA لكل 1 مل من EC + bFGF).
   ملاحظه: يمكن أيضا تحقيق التمايز الناجح دون مكملات التهاب المفاصل الروماتويدي في اليومين 6 و 8. ومع ذلك ، فإن إغفال RA سيؤدي إلى BECs مع انخفاض TEER.
6. قم بتغطية ألواح زراعة الخلايا وإدخالات الغشاء (على سبيل المثال ، Transwell) بالكولاجين الرابع والفيبرونيكتين (اليوم 7) ، لتنقية BECs والتجارب التالية.
   1. لطلاء إدخالات الغشاء ، امزج 4 أجزاء من الكولاجين الرابع (1 مجم / مل في 0.5 مجم / مل من حمض الأسيتيك) ، وجزء واحد من الفيبرونيكتين (1 مجم / مل) و 5 أجزاء من الماء المعقم من درجة الأنسجة. يمكن تخفيف محلول ECM بنسبة 1: 5 لطلاء ألواح زراعة الخلايا (أي 4 أجزاء من الكولاجين الرابع ، جزء واحد من الفيبرونكتين ، 45 جزءا من الماء). احتضن بمحلول الطلاء عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
      ملاحظة: يمكن أيضا طلاء الألواح وإدخالات الأغشية لمدة 4 ساعات على الأقل قبل الزراعة الفرعية في نفس يوم خطوة التنقية.
7. قم بتنقية BECs عن طريق زراعة الخلايا المتمايزة على الكولاجين الرابع والصفائح المطلية بالفيبرونكتين أو إدخالات الغشاء (اليوم 8).
   1. شفط وسط EC وأضف كاشف تفكك الخلايا الأنزيمي (12 مل لكل T75). احتضان عند 37 درجة مئوية حتى تنفصل 90٪ من الخلايا عن القارورة.
      ملاحظه: يمكن أن يستغرق تفكك الخلايا ما يصل إلى 1 ساعة.
   2. خلال وقت الحضانة ، قم بإزالة محلول طلاء الكولاجين IV / الفبرونيكتين من الألواح / الإدخالات المعدة مسبقا واتركها تجف في غطاء معقم. يستغرق الجفاف حوالي 20 دقيقة.
   3. بمجرد انفصال الخلايا ، اغسلها من القارورة باستخدام ماصة سعة 10 مل. الماصة لأعلى ولأسفل لتحقيق تعليق خلية واحدة.
      ملاحظه: يعد تعليق الخلية المفردة أمرا مهما لعد الخلايا الموثوق به وتحقيق طبقات أحادية صلبة.
   4. خفف بحجم متساو على الأقل من hESFM الطازج في أنبوب مخروطي سعة 50 مل وعد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم.
   5. حبيبات الخلايا في 1,500 × جم لمدة 10 دقائق.
   6. أعد تعليق الخلايا بحجم مناسب من EC + bFGF + RA المحضر حديثا لتحقيق تعليق 2 × 10⁶ خلايا / مل للبذر على إدراج الغشاء. أضف 500 ميكرولتر (1 × 10⁶ خلايا) فوق ملحق 12 بئرا و 1.5 مل من وسط EC + bFGF + RA في الأسفل. للبذر على ألواح 24 و 48 بئرا ، قم بتخفيف تعليق الخلية 1: 2 وإضافة 500 ميكرولتر (5 × 105 خلايا) و 250 ميكرولتر (2.5 × 10⁵ خلايا) لكل بئر ، على التوالي. قم بتوزيع الخلايا بالتساوي عبر البئر / الإدخال واحتضانها عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
8. قم بتغيير الوسائط الموجودة على الألواح / الآبار إلى EC بدون bFGF أو RA (اليوم 9).

المواد