عزل الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون من الأنسجة الدهنية الفئران حول الأبهر

الملخص

المصدر: Qi, Y., et al. العزل ، الثقافة ، والحث الشحمي للخلايا الجذعية الأصلية المشتقة من الدهون من القمة العصبية من الأنسجة الدهنية حول البيئ. J. Vis. Exp. (2020)

يوضح هذا الفيديو تقنية لعزل واستزراع الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون المشتقة من القمة العصبية (ADSCs) المصنفة بالفلورسنت من الأنسجة الدهنية حول قوس الفئران. بعد العزل ، يتم اكتشاف NCADSCs وفرزها باستخدام فرز الخلايا المنشط بالفلورة ، ثم يتم زراعتها لاحقا على طبق ، مما يعزز تكاثر الخلايا.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

< p class = "jove_title" >1. عزل الكسر الوعائي اللحمي (SVF)

< p class = "jove_content" > اجمع الأنسجة الدهنية حول الأبهر (PAAT) من 5-6 فئران في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل يحتوي على 1 مل من وسط الهضم الطازج وفرم الأنسجة باستخدام مقص جراحي في أنبوب Eppendorf في درجة حرارة الغرفة (RT).

1. انقل المزيج إلى أنابيب سعة 50 مل تحتوي على 9 مل من وسط الهضم. قم بتجانس الأنسجة عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة سعة 1 مل 10x.
2. احتضان الأنابيب عند 37 درجة مئوية مع الرج المستمر عند 100 دورة في الدقيقة لمدة 30-45 دقيقة وافحصها كل 5-10 دقائق لمنع فرط الهضم. هذا أمر بالغ الأهمية لتحسين صلاحية الخلية وإنتاجيتها.
   ملاحظه: سيؤدي الهضم الجيد للأنسجة إلى نسيج دهني أصفر فاتح متجانس يمكن رؤيته للعين المجردة عند تحريك الأنبوب برفق.
3. أوقف عملية الهضم عن طريق إضافة 5 مل من HDMEM تحتوي على 10٪ FBS و1٪ حجم/حجم PS عند RT واخلطها جيدا عن طريق سحب العينات.
4. جهاز الطرد المركزي لتعليق الخلية عند 500 × جم لمدة 5 دقائق في RT. سيكون SVF مرئيا على شكل حبيبات بنية اللون. استنشق الخلايا الشحمية العائمة بعناية وصب المادة الطافية المتبقية دون إزعاج SVF. قم بإذابة حبيبات SVF في 10 مل من وسط الاستزراع وقم بالتصفية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر.
قم
5. بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 500 × جم لمدة 5 دقائق ، وقم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات برفق في 5 مل من محلول تحلل كريات الدم الحمراء في أنبوب مخروطي سعة 15 مل لمدة 10 دقائق في RT.
6. أوقف التفاعل بإضافة 10 مل من 1x PBS يحتوي على 1٪ FBS. قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وقم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 10 مل من 1x PBS تحتوي على 1٪ FBS.
7. قم بالطرد المركزي للخلايا مرة أخرى عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الحبيبات في 5 مل من وسط الثقافة في أنبوب مخروطي 15 مل عند 4 درجات مئوية.
8. بعد جولة أخيرة من الطرد المركزي (500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية) ، أعد تعليق الخلايا المحببة في 5 مل من المخزن المؤقت FACS (PBS الذي يحتوي على 10٪ FBS ، و 100 وحدة / مل من الحمض النووي I ، و 1٪ v / v PS) على الجليد ، واحسب الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم.

2. عزل NCADSCs بواسطة FACS

1. قم بإعداد فارز الخلايا وتحسينه باتباع دليل التعليمات. حدد فوهة 100 ميكرومتر ، وقم بتعقيم أنابيب التجميع ، وقم بتثبيت جهاز التجميع المطلوب ، وقم بإعداد التيارات الجانبية.
2. لفرز خلايا RFP + ، يوصى باستخدام ليزر أصفر / أخضر 561 نانومتر ومرشح بصري 579/16. قم بإجراء التعويض باستخدام التحكم السلبي وعناصر التحكم الإيجابية أحادية الصبغة. انظر الشكل 1 أ لمخطط البوابات.
3. قم بتصفية الخلايا من خلال مصفاة 40 ميكرومتر ، وجهاز طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق ، وأعد تعليقها في 2 مل من المخزن المؤقت FACS بكثافة 0.5-1 × 10⁷ / مل. انقل الخلايا إلى أنابيب البوليسترين المستديرة القاع سعة 5 مل ذات العلامات الواضحة وقم بتحميلها في آلة الفرز.
4. قم بتشغيل أنبوب العينة التجريبي عند 4 درجات مئوية ، وقم بتشغيل ألواح الانحراف ، وفرزها في أنبوب مخروطي سعة 15 مل مطلي مسبقا ب RPMI يحتوي على 1٪ FBS و 1٪ v / v PS.
   ملاحظه: حماية العينات من الضوء القوي لتقليل تبريد RFP.

< p class = "jove_title" >3. ثقافة NCADSCs

1. قم بوضع الخلايا المصنفة بكثافة 5,000 خلية / سم² في صفيحة زراعة 12 بئرا في وسط استزراع كامل واحتضانها عند 37 درجة مئوية في جو رطب مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 20-24 ساعة.
2. قم بإزالة وسط الاستزراع ، واغسل الخلايا باستخدام PBS دافئ مسبقا (37 درجة مئوية) لإزالة بقايا الخلية ، وإضافة وسط ثقافة جديد.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: التمايز الحممي ل NCADSCs المعزولة من PAAT. (أ) مخطط البوابات العام لتوصيف وفرز مجموعات NCADSCs (RFP). (ب) تظهر صور المجهر الفلوري أن NCADSCs التزمت وتوسعت بعد 96 ساعة من البذر على صفيحة استزراع 12 بئر. (C-G) صور تمثيلية تظهر أن اللون الأحمر الزيتي O ملطخ ب NCADSCs من PAAT بعد الحث الحموي. (ج) التحكم (بدون تحريض). ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات جيش صرب البوسنه علوم الحياة VWR 0332-100 جرام تركيز العمل 50 مجم / مل ؛ الكثير #: 0536C008 كولاجيناز ، النوع الأول جيبكو 17018029 عازلة تحلل كريات الدم الحمراء إنفيتروجين 00-4333 FBS كورنينج R35-076-السيرة الذاتية تركيز العمل 50 مجم / مل ؛ الكثير #: R2040212FBS HBSS جيبكو 14025092 إتش دي إم إيم علوم الحياة SH30243.01 الكثير #: AD20813268 PBS (محلول ملحي مخزن بالفوسفات) ABCONE (الصين) ص 41970 البنسلين - ستربتومايسين جيبكو 15140122