عزل الخلايا الدبقية المعوية من تحت الغشاء المخاطي والصفيحة المخصوصة للفأر

الملخص

المصدر: Wang، Z. et al. ، عزل الخلايا الدبقية المعوية عن تحت الغشاء المخاطي والصفيحة المخصوصة للفأر البالغ.J. Vis. Exp. (2018).

يوضح هذا الفيديو طريقة لعزل الخلايا الدبقية المعوية من تحت الغشاء المخاطي والصفيحة المخصوصة في أمعاء الفأر. يحدد الخطوات المتبعة في استخراج أنسجة تحت الغشاء المخاطي والصفيحة المخصوصة ، وعزل الخلايا الدبقية المعوية عنها ، وزراعة الخلايا على صفيحة بئر مغلفة لإنشاء ثقافة الخلايا الدبقية المعوية.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

فئة

1. تحضير محاليل Poly-D-lysine المعقمة (PDL) و Laminin

1. قبل يوم واحد على الأقل من عزل الخلايا ، قم بإعداد بولي دي ليسين (PDL) وألواح مطلية باللامينين.
   ملاحظه: تم تحضير كل من الألواح المكونة من 6 بئر و 12 بئرا اعتمادا على الأهداف التجريبية. عادة ، تم استخدام ألواح مكونة من 12 بئرا للتحليل الكمي باستخدام البقع الغربية ، بينما تم استخدام ألواح 6 آبار لحمل أغطية معقمة (معقمة) للكيمياء المناعية. تم استخدام صفائح 24 بئرا لزراعة الخلايا الدبقية المعوية (EGCs) لتصوير تدفق Ca²⁺.
قم
2. بتخفيف محاليل المخزون بدرجة زراعة الأنسجة فائقة النقاء ، وخالية من DNase ، وخالية من RNase في شفاط زراعة الأنسجة مع هواء مفلتر HEPA.
3. تعقيم الأغطية الزجاجية
   1. امسك الغطاء بملقط معقم واغمر الغطاء في دورق من الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 15 دقيقة. اترك الإيثانول يتبخر في غطاء مزرعة الأنسجة ثم ضعه في الألواح المكونة من 6 آبار.
   2. بدلا من ذلك ، ضع عدة أغطية بشكل فردي على ورق نشاف بسمك 2 مم في وعاء بلاستيكي ثم الأوتوكلاف.

فئة < p = "jove_title" >2. لوحات الطلاء

ملاحظة: قم بتنفيذ هذه الخطوات تحت غطاء التدفق الصفحي لثقافة الأنسجة المعقمة.

1. قم بإذابة مخزون PDL 1 مجم / مل وقم بتخفيفه بنسبة 1:10 بماء معقم من درجة زراعة الأنسجة بحيث يكون التركيز النهائي 100 ميكروغرام / مل. استخدم 2 مل لكل بئر لتغطية ألواح 6 آبار ، و 1 مل لتغطية بئر واحد من صفيحة 12 بئرا ، و 0.5 مل لبئر واحد في الألواح المكونة من 24 بئرا. قم بتخزين PDL المخفف المتبقي في 12 مل من كميات عند -20 درجة مئوية.
2. بعد السماح ل PDL بتغطية الآبار لمدة 1 ساعة على الأقل ، قم بإزالة PDL بماصة معقمة. اترك الألواح تجف تماما في الهواء تحت غطاء التدفق الصفحي لثقافة الأنسجة.
   ملاحظه: بعد إزالة محلول PDL بماصة معقمة، يمكن استخدامه مرتين أخريين في غضون أسبوع واحد بعد المرور عبر مرشح 0.22 ميكرومتر وتخزينه عند 4 درجات مئوية.
3. قم بإذابة مخزون اللامينين على الجليد لتجنب تكوين الجل.
   ملاحظه: يصبح اللامينين غير المخفف صلبا عند تسخينه فوق 8 درجات مئوية.
4. خفف مخزون اللامينين (0.5 مجم / مل) 1:50 باستخدام محلول ملحي معقم بالفوسفات (DPBS) من دولبيكو للحصول على تركيز نهائي يبلغ 10 ميكروغرام / مل. قم بتخزين اللامينين المخفف في 12 مل عند -20 درجة مئوية.
5. أضف اللامينين المخفف إلى الآبار التي تحتوي على PDL المجفف. استخدم 1 مل لتغطية سطح 6 آبار و 0.5 مل لتغطية قاع الألواح المكونة من 12 بئرا. بالنسبة للأغطية ، أضف 400 ميكرولتر من اللامينين المخفف إلى الغطاء لتحقيق تغطية السطح.
6. احتضان الألواح المطلية عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين ، إذا تم استخدام اللوحة في نفس اليوم (طلاء سريع). إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقم بإغلاق الألواح بغلاف بلاستيكي وتخزينها طوال الليل عند 4 درجات مئوية (طلاء بطيء).
   ملاحظه: الختم أمر بالغ الأهمية لتجنب الجفاف والتلوث.
7. قم بإزالة محلول اللامينين بعناية باستخدام ماصة لتجنب خدش السطح. اغسل الآبار برفق ثلاث مرات باستخدام DPBS معقم.
8. أضف وسائط نمو دبقية كاملة إلى كل بئر وحافظ على الألواح عند 37 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة لإضافة تعليق EGC.
   ملاحظه: يمكن تخزين الألواح المطلية بالليسين واللامينين Poly-D لمدة 3 أيام عند 4 درجات مئوية. قم بتغطية الألواح قبل عدة أيام ثم تخزينها في 4 درجات مئوية ؛ اغسل الأطباق بمحلول ملحي معقم بالفوسفات (DPBS) من Dulbecco ثلاث مرات. أضف 2 مل من DPBS المعقم إلى كل بئر بعد الغسيل النهائي. أغلق الطبق بالبارافيلم واحفظه في درجة حرارة 4 درجات مئوية. من الضروري التأكد من أن اللامينين لا يجف.

3. تحضير حلول العزل

1. قم بإعداد محلول التفكك EDTA / HEPES / DPBS. للحصول على 500 مل من المحلول ، استخدم DPBS معقم (بدون الكالسيوم والمغنيسيوم) لعمل محلول نهائي من 10 ملي مولار HEPES و 5 ملي EDTA. إلى 490 مل من DPBS ، أضف 5 مل من 1 M HEPES المؤقت و 5 مل من محلول مخزون 0.5 M EDTA. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
2. قم بإعداد وسائط إعادة تعليق الخلايا الدبقية باستخدام الكواشف المدرجة في الجدول 1.
3. تحضير وسائط النمو الدبقي باستخدام الكواشف المدرجة في الجدول 2.
   ملاحظه: يمكن تخزين وسائط النمو الدبقية التي تحتوي على GDNF لمدة أسبوع واحد عند 4 درجات مئوية.

< p class = "jove_title" >4. إزالة الجزء المعوي

ملاحظة: سمح للفئران بالوصول المجاني إلى الطعام والماء قبل القتل الرحيم بطريقة إسقاط الأيزوفلوران وإزالة عضو حيوي. تم استخدام C57BL / 6 فئران يزيد عمرها عن 8 أسابيع. تم استخدام كلا الجنسين دون اختلافات ملحوظة في التحضير.

1. قم بالقتل الرحيم للفأر بجرعة زائدة من الأيزوفلوران وضعه في صينية تشريح. قم بتثبيت الأطراف وتعقيم البطن بنسبة 70٪ من الإيثانول. خيمة الجلد بالملقط ثم افتح البطن بالمقص.
2. ارفع الكبد وحدد المعدة البعيدة / البواب. ثم قم بإزالة 7 سم من الأمعاء القريبة. احرص على عدم تمزق الأمعاء.
3. أمسك البواب بالملقط أثناء قص المساريق.
   1. استخدم تشريحا حادا مع الجزء الخلفي من المقص لكشط البنكرياس الملتصق.
   2. ضع الجزء المعوي في DPBS المثلج بدون Ca²⁺ أو Mg²⁺ (الشكل 1 أ).
      ملاحظه: يمكن أيضا إزالة أجزاء أخرى من الأمعاء أو القولون باستخدام نفس التقنية.
4. استخدم حقنة سعة 5 أو 10 مل متصلة بإبرة غير حادة 20 جم لطرد محتويات البراز باستخدام DPBS المثلج (الشكل 1 ب).
5. قسم الأمعاء إلى شرائح 3 سم لإزالة العضلة الطولية. ملاحظة: يتم استخدام أجزاء معوية من ما يصل إلى فأرين لكل 30 مل من محلول عزل HEPES / EDTA / DPBS.
6. اقطع حوالي 4 سم لفصل العصا الخشبية عن طرف القطن. انقع العصا الخشبية في DPBS (الشكل 1 ج).
7. انزلق أحد أجزاء الأمعاء بسلاسة على العصا المبللة (الشكل 2A-C).
8. قم بإزالة المساريق الملتصق الذي لا يزال متصلا باستخدام ملقط أنف الإبرة (الشكل 2 د).
9. استخدم شفرة حلاقة نظيفة أو مشرط لعمل شقين طوليين على طول الأمعاء حيث تم توصيل المساريق (الشكل 2 ه).
   1. بلل طرف القطن باستخدام DPBS. افركي طرف القطن المبلل طوليا على طول العضلة لفك العضلة الطولية / الضفيرة العضلية المعوية (LMMP). بعد ذلك ، حرك طرف القطن أفقيا لإبعاد LMMP عن العضلة الدائرية على طول الجزء المعوي أثناء إزالة LMMP.
   2. أمسك طرف العصا بين الإبهام والسبابة مع تثبيت الجزء بالإصبع الأوسط والرابع (الشكل 2F). عند الانتهاء ، سوف يقشر LMMP الجزء المعوي بسهولة.
10. تخلص من LMMP الذي تم تجريده من الأنبوب المعوي وتثبيته بقطعة قطن ما لم يكن من المطلوب حصاد EGCs من الضفيرة العضلية المعوية.
11. استخدم شفرة حلاقة لفتح الجزء المعوي طوليا لإزالته من العصا الخشبية.
12. قم بتخزين الأنسجة المعوية المجردة (في الغالب الغشاء المخاطي وتحت الغشاء المخاطي بالإضافة إلى العضلات الدائرية) في DPBS على الجليد. كرر الخطوات 4.4-4.11 حتى يتم تحضير جميع أجزاء الأمعاء.

< p class = "jove_title" >5. إزالة الغشاء المخاطي الظهاري

1. قطع الأمعاء إلى قطع أصغر من ~ 0.5 سم بمقص ناعم.
2. ضع الأنسجة في أنبوب طرد مركزي مخروطي معقم سعة 50 مل يحتوي على 30 مل من محلول EDTA / HEPES / DPBS المثلج.
3. هز المحلول المحتوي على الأنسجة عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق عند ~ 60 إمالة في الدقيقة.
4. قم بترطيب ماصة بلاستيكية سعة 5 مل مسبقا عن طريق سحب المخزن المؤقت EDTA/HEPES/DPBS لأعلى ولأسفل مرة واحدة، ثم استخدم الماصة المبللة مسبقا لسحب الأنسجة وتعليق التعليق لأعلى ولأسفل (التخلي) 20 مرة لإخراج الغشاء المخاطي الظهاري.
5. اجمع الأنسجة من حضانة EDTA عن طريق صب الخليط من خلال مصفاة خلايا نايلون 100 ميكرومتر. تخلص من التدفق العكر المليء بالمخاط (الشكل 3).
6. ضع الأنسجة المحتجزة في المصفاة في أنبوب طرد مركزي مخروطي جديد سعة 50 مل يحتوي على 30 مل من EDTA / HEPES / DPBS المثلج باستخدام ملقط إبرة الأنف.
7. كرر حضانة EDTA / HEPES / DPBS مرة ثانية عن طريق هز الأنسجة عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق عند ~ 60 إمالة في الدقيقة لتجريد الغشاء المخاطي الظهاري الإضافي.
قم
8. بترطيب ماصة سعة 5 مل مسبقا باستخدام المخزن المؤقت ثم قم بسحب تعليق الأنسجة لأعلى ولأسفل 20 مرة لإخراج الخلايا المخاطية.
   ملاحظه: تميل الأنسجة إلى الالتصاق بداخل الماصة مع إزالة المزيد من الظهارة.
9. اجمع الأنسجة بعد الحضانة الثانية عن طريق صب الخليط من خلال مصفاة خلية نايلون 100 ميكرومتر وتخلص من التدفق من خلالها. يجب أن يكون التدفق الثاني أقل تعكرا بشكل ملحوظ من الأول (الشكل 3).
10. كرر حضانات EDTA لمدة 10 دقائق حتى يصبح المحلول واضحا تقريبا (حوالي 3 إلى 4 حضانات اعتمادا على كمية الأنسجة وفعالية التخليذ) (الشكل 3).

< p class = "jove_title" >6. مجموعة من الخلايا الدبقية المعوية من الصفيحة المخصوصة وتحت الغشاء المخاطي

1. انقل الأنسجة من مصفاة النايلون إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 15 مل يحتوي على 5 مل من محلول استعادة الخلايا المتاح تجاريا والصخور لمدة 25-30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
2. تريتورات بلطف 10x لفصل الخلايا الدبقية المعوية عن الصفيحة المخصوصة.
   1. قم بالتصفية من خلال مرشح 40 ميكرومتر واجمع المرشح في أنبوب نظيف سعة 50 مل.
   2. اشطف المنديل الموجود على مرشح النايلون ب 1 مل من DPBS.
   3. تخلص من الأنسجة وانقل ~ 5-6 مل من المرشح إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي الشكل نظيف سعة 15 مل.
   4. قم بتدوير المرشح عند 2,000 × جم في جهاز طرد مركزي دلو متأرجح لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
3. أعد تعليق الحبيبات المحتوية على الخلايا الدبقية في 1 مل على الأقل من المخزن المؤقت لإعادة التعليق عن طريق سحب الحبيبات برفق لأعلى ولأسفل باستخدام طرف ماصة 500 ميكرولتر. تجنب إدخال فقاعات.
   ملاحظه: اضبط حجم إعادة التعليق حسب الحاجة لعدد الآبار والألواح. على سبيل المثال ، 1.2 مل للوحة واحدة مكونة من 6 آبار ، و 2.4 مل للوحين من 6 آبار ، و 2.4 مل للوحة واحدة مكونة من 12 بئرا.
4. ماصة 200 ميكرولتر من تعليق الخلية في كل بئر من 6 بئر أو 100 ميكرولتر لألواح مطلية ب 12 بئرا PDL-laminin تحتوي على وسائط نمو دبقية.
5. لا تزعج الأطباق بعد إضافة الخلايا إلى الأطباق ووضعها في الحاضنة 37 درجة مئوية للسماح لأكبر عدد ممكن من الخلايا بالالتصاق.
   ملاحظه: سوف يرتبط مستحضر صحي للخلايا في غضون 6-8 ساعات ، ولكن انتظر لمدة 24 ساعة على الأقل قبل تغيير الوسائط عن طريق سحب الوسائط برفق مع الخلايا غير الملتصقة.
6. استخدم الخلايا للتجارب بعد 3-4 أيام من وضعها في الثقافة (الشكل 4).

< p class = "jove_content" > الجدول 1. تكوين وسائط إعادة تعليق الخلايا الدبقية.

مكونات الحجم المراد إضافته التركيز النهائي DMEM / F12 44.5 مل _ مصل الأبقار الجنينية (FBS) 5 مل 10٪ البنسلين - ستربتومايسين 500 ميكرولتر 100 وحدة دولية / مل قلم الستربتومايسين 100 ميكروغرام / مل البكتيريا العقدية جنتاميسين (50 مجم / مل مخزون) 20 ميكرولتر 20 ميكروغرام / مل < p class = "jove_content" > الجدول 2. تكوين وسائط نمو الخلايا الدبقية

مكونات الحجم المراد إضافته التركيز النهائي DMEM / F12 44 مل _ مصل الأبقار الجنينية (FBS) 5 مل 10٪ البنسلين الستربتومايسين (100x) 500 ميكرولتر 100 وحدة دولية / مل (قلم) 100 ميكروغرام / مل (البكتيريا) جنتاميسين (50 مجم / مل مخزون) 20 ميكرولتر 20 ميكروغرام / مل GDNF (مخزون 10 ميكروغرام / مل) 50 ميكرولتر 10 نانوغرام / مل

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: إعداد وإعداد أمعاء الفئران.(أ) صورة للعزلة التي تم إنشاؤها على الجليد بما في ذلك الأمعاء المستخرجة. (ب) صورة لحقنة سعة 5 مل متصلة بإبرة نهاية حادة 20 جم لطرد محتويات البراز. (ج) نهاية هندسية لقطعة قطن خشبية (~ 4 سم) تنقع في المخزن المؤقت DPBS.

< p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات بولي دي ليسين (1 مجم / مل مخزون) سيغما أ -003 ه تمييع 1:10 Laminin (0.5 مجم / مل مخزون) سيغما L4544 خفف إلى 10 ميكروغرام / مل على ICE EDTA (0.5 م) لونزا 51201 تخفيف 1:100 في DPBS هيبس (1 م) كورنينج 36216004 تخفيف 1:100 في DPBS حل استعادة الخلايا كورنينج 354253 محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (DPBS) HyClone SH30028.02 DMEM / F-12 ثيرمو فيشر العلمي 11320033 البنسلين الستربتومايسين (100X) تقنيات الحياة 15140-122 جنتاميسين (مخزون 50 مجم / مل) تقنيات الحياة 15750060 GDNF (مخزون 10 ميكروغرام) سيغما SRP3200 L-Glutamine (مخزون 200 مل) تقنيات الحياة هاتف: 25030-081 مصفاة سيل شبكية من النايلون (100 ميكرومتر) فيشر ساينتيك 22363549 مصفاة شبكة النايلون (40 ميكرومتر) فيشر ساينتيك 22363547 ماصة مصلية يمكن التخلص منها 5 مل فيشر ساينتيك 13-678-11 د 0.25٪ تريبسين EDTA (1X) تقنيات الحياة هاتف: 25200-056