تنقية الشعيرات الدموية من دماغ الخنازير

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Nielsen، S. S. E.، et al. طريقة محسنة لإنشاء نموذج حاجز الدم الدماغي في المختبر يعتمد على الخلايا البطانية لدماغ الخنازير. J. Vis. Exp. (2017).

يوضح هذا الفيديو عزل الشعيرات الدموية عن أدمغة الخنازير الطازجة. تتضمن العملية إزالة السحايا ، وعزل المادة الرمادية من أنسجة المخ ، وتجانس المادة الرمادية وتصفيتها لعزل الشعيرات الدموية ، وأخيرا استخدام الهضم الأنزيمي لتنقية الشعيرات الدموية بشكل أكبر.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

< ص الفئة = "jove_title" >1. تنقية الشعيرات الدموية في دماغ الخنازير

1. اجمع 8-10 أدمغة من الخنازير الداجنة البالغة من العمر 5-6 أشهر (على سبيل المثال من مسلخ قريب) وانقلها على الجليد إلى المختبر. نوصي ببدء إجراء التنقية التالي في غضون 2-3 ساعات من إنهاء.
2. ضع الأدمغة في مقعد تدفق معقم واغسلها برفق باستخدام 1 لتر PBS في دورق يوضع على الثلج.
3. قم بإزالة السحايا بعناية من دماغ واحد في كل مرة باستخدام ملقط رفيع الأطراف، وانقل الأدمغة الخالية من السحايا إلى دورق آخر سعة 1 لتر مع وضع PBS على الجليد. يمكن أن يؤدي تمديد الوقت المستغرق إلى تعقيد عملية الإزالة. يجب أن يكون الوقت التقريبي المستخدم لكل دماغ 10-15 دقيقة.
4. باستخدام مشرط ، اكشط المادة الرمادية من دماغ واحد في كل مرة وانقل المادة المعزولة إلى أطباق بتري (8.8 سم²) تحتوي على 20 مل من خليط المغذيات DMEM F-12 (DMEM / F-12) الموضوعة على الجليد. اعزل أكبر قدر ممكن من المادة الرمادية دون سحب مادة المادة البيضاء. للتجزئة الأولية ، قم بتشغيل مادة المادة الرمادية من خلال حقنة سعة 50 مل بدون إبرة. استمر في جميع العقول وقم بتجميع مادة المادة الرمادية التي تم جمعها. يمكن أن يؤدي تمديد الوقت المستغرق إلى تعقيد عملية الإزالة. يجب أن يكون الوقت التقريبي المستخدم لكل دماغ 10-15 دقيقة.
5. انقل مادة المادة الرمادية المعزولة إلى أنبوب المطحنة لمخالط الأنسجة المحمول باليد بنسبة 50/50 باستخدام وسائط DMEM / F-12. قم بتجانس المادة عن طريق عمل 8 ضربات لأعلى ولأسفل باستخدام مدقة فضفاضة ، متبوعة ب 8 ضربات لأعلى ولأسفل بمدقة ضيقة. استمر حتى يتم تجانس جميع المواد المعزولة ، ثم انقل الجانس إلى زجاجة سعة 500 مل وقم بتخفيفه باستخدام DMEM / F-12 إلى الحجم الكلي 450 مل تقريبا.
6. قم بتصفية الجانسة باستخدام زجاجة ذات غطاء أزرق سعة 500 مل مع حامل مرشح وشبكة مرشح 140 ميكرومتر ، وعزل الشعيرات الدموية عن طريق تمرير الأنسجة عبر الفلتر. استخدم مرشحا واحدا لكل 50 مل من التجانس واغسل كل مرشح باستخدام DMEM / F-12 بعد ذلك.
7. ضع المرشحات المحتوية على الشعيرات الدموية في أطباق بتري بمحلول هضم من التربسين / EDTA (2.5٪ تربسين ، 0.1 نانومتر EDTA في PBS) ، الكولاجيناز CLS2 (2,000 وحدة / مل) و DNase 1 (3,400 وحدة / مل) في DMEM / F-12. استخدم 1 طبق بتري (محلول 8.8 سم² ، 20 مل) لكل 3 شبكات مرشح.
8. ضع أطباق بتري على حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على شاكر مداري عند 180 دورة في الدقيقة أو حركها برفق كل 10 دقائق. بعد 1 ساعة ، اغسل الشعيرات الدموية من المرشحات مع تعليق من طبق بتري باستخدام ماصة 1 مل.
9. قسم المعلق من الأطباق الثلاثة إلى 2 أنبوب سعة 50 مل وأوقف عملية الهضم عن طريق إضافة 10 مل DMEM / F-12 إلى كل أنبوب سعة 50 مل.
10. قم بالطرد المركزي لمعلقات الخلية عند 250 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. أضف 20 مل أخرى من DMEM / F12 إلى كل أنبوب. كرر خطوة الطرد المركزي هذه مرتين.
11. دع الأنابيب تبرد على الجليد لمدة 5 دقائق وانقل المحاليل إلى أنبوبين جديدين سعة 50 مل.
قم
12. بالطرد المركزي لمعلقات الخلية عند 250 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق ، وأعد تعليق كل حبيبات في 8-10 مل (حوالي 1 مل / دماغ مستخدم) من محلول التجميد الذي يتكون من 10٪ DMSO في FBS.
13. انقل معلق الخلية إلى cryovials ، باستخدام 1 مل لكل cryovial. في المتوسط ، ينتج عن التنقية قارورة واحدة لكل دماغ مستخدم ، في المتوسط توفر الخلايا البطانية ل 12-16 إدراج. ضع القوارير في صندوق تجميد عند -80 درجة مئوية لمدة 4 ساعات على الأقل حتى ليلة وضحاها. بعد ذلك ، قم بتخزين المبردات في خزان التبريد مع النيتروجين السائل.
    أنذر: النيتروجين السائل له درجات حرارة منخفضة للغاية. يرجى ارتداء الحماية المناسبة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات DMEM / F-12 لونزا BE12-719F مصل الأبقار الجنينية (FBS) جيبكو إنفيتروجين 10-270-106 التربسين / EDTA جيبكو إنفيتروجين 15090-046 DMSO سيجما ألدريتش 34896 برنامج تلفزيوني سيجما ألدريتش د8537 الحمض النووي 1 سيجما ألدريتش د4513 كولاجيناز CLS2 سيجما ألدريتش [ك6885] ddH2O مصنوع من نظام Elga أنابيب طرد مركزي سعة 15 مل سيلستار 188271 أنابيب الطرد المركزي 50 مل سيلستار 227261 أطباق بتري الترمو: العلمية هاتف 150350 قوارير التبريد الترمو: العلمية 377224 زجاجة 500 مل الترمو: العلمية 159910/159920 المشارط سوان مورتن REF0211 اكتب 24 الخالط الأنسجة سيغما د9188 مرشحات 140 ميكرومتر ميرك NY4H04700 ملقط منحني رفيع الرأس KLS مارتن 12-409-12-07 ملقط عريض VWR 82027-390 حامل الفلتر ميرك ميليبور سوينكس -47 حقنة 50 مل براون 4617509 فهرنس