تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد. يتم تصوير التدفق الإجرائي للبروتوكول في الشكل 1.
1. إعداد الإجراء
- تحضير المخزن المؤقت للأوعية الدقيقة للدماغ (BMB). ابدأ بوزن 54.66 جم D-mannitol و 1.90 جم EGTA (إيثيلين جلايكول مكرر (2-أمينوإيثيل إيثر) -N ، N ، N ′ ، N حمض رباعي الأسيتيك) ، و 1.46 جم 2-أمينو -2- (هيدروكسي ميثيل) -1،3-بروبانديول (أي تريس) في دورق نظيف. أضف 1.0 لتر من الماء منزوع الأيونات. امزج مكونات المخزن المؤقت BMB باستخدام محرك مغناطيسي. بمجرد خلط المحلول جيدا ، اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 باستخدام 1.0 M HCl.
- قم بإعداد محلول ديكستران بنسبة 26٪ (ميجاوات 75,000) (وزن / حجم) قبل تخدير. اتبع الخطوات التالية لتحضير محلول ديكستران.
ملاحظه: من المهم للغاية تحضير هذا المحلول في وقت مبكر لأن ديكستران يمكن أن يستغرق حوالي 1.5-2 ساعة ليذوب في مخزن مائي.
- قم بوزن مسحوق الديكستران (26 جم لكل 100 مل عازلة) في دورق نظيف.
- قم بقياس الحجم المناسب من BMB وقم بتوزيعه في دورق منفصل ونظيف.
- صب BMB ببطء في الدورق الذي يحتوي على مسحوق ديكستران. أثناء صب BMB ، اخلطي مسحوق الديكستران يدويا باستخدام قضيب تقليب زجاجي.
- اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 باستخدام 1.0 M HCl مباشرة قبل الاستخدام.
ملاحظه: يتطلب العزل النموذجي للأوعية الدقيقة في الدماغ من 12 فأرا فرديا من Sprague-Dawley (ذكر أو أنثى ؛ 3 أشهر من العمر ؛ 200-250 جم لكل منهما) 200 مل من محلول ديكستران (أي 52 جم ديكستران في 200 مل من BMB).
< p class = "jove_title" >
2. استخراج أنسجة المخ من فئران Sprague-Dawley
- بعد العلاج التجريبي المطلوب ، قم بتخدير فئران Sprague-Dawley باستخدام الكيتامين (50 مجم / كجم ؛ 2.5 مل / كجم من الداخل الصفري) والزيلازين (10 مجم / مل ؛ 2.5 مل / كجم I ، p.). يخفف الكيتامين والزيلازين في محلول ملحي 0.9٪ إلى تركيزات نهائية تبلغ 20 مجم / مل و 4.0 مجم / مل ، على التوالي. قتل عن طريق قطع الرأس باستخدام مقصلة حادة وفقا لإرشادات IACUC (اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام). استخدم نفس الإجراء لكل من ذكور وإناث فئران Sprague-Dawley.
- قم باستئصال الجلد من جمجمة الفئران عن طريق عمل قطع عرضي واحد باستخدام مقص جراحي.
- باستخدام rongeur ، قم بإزالة صفيحة الجمجمة بعناية وفضح الدماغ.
- قم بإزالة الدماغ باستخدام ملعقة. افصل المخ وضع أنسجة المخ المعزولة في أنبوب مخروطي سعة 50 مل يحتوي على 5 مل من BMB. أضف 1.0 ميكرولتر من كوكتيل مثبط الإنزيم البروتيني لكل 1.0 مل من عازلة BMB مباشرة قبل الاستخدام.
< p class = "jove_title" >
3. معالجة الدماغ
- انقل أنسجة المخ من الأنبوب المخروطي سعة 50 مل إلى طبق بتري نظيف.
- باستخدام الملقط ، قم بلف الدماغ برفق على ورق ترشيح قطره 12.5 سم لإزالة السحايا الخارجية ، والتي تلتصق بشكل فضفاض بالقشرة الدماغية. اضغط برفق على أنسجة المخ على ورق الترشيح ولف المنديل مرة أخرى. اقلب ورق الترشيح بشكل متكرر أثناء هذه الخطوة.
- افصل الضفيرة المشيمية عن نصفي الكرة المخية باستخدام الملقط.
ملاحظه: تظهر الضفيرة المشيمية كنسيج غشائي شفاف موضعي على سطح البطينين الدماغيين.
- قم بتسطيح أنسجة المخ برفق وإزالة السحايا والبصيلات الشمية المتبقية باستخدام الملقط.
- ضع أنسجة المخ القشرية في هاون زجاجي مبرد. أضف 5.0 مل من كوكتيل BMB الذي يحتوي على مثبطات الإنزيم البروتيني إلى الهاون.
- باستخدام الخالط الكهربائي العلوي ، قم بتجانس أنسجة المخ باستخدام 15 ضربة لأعلى ولأسفل عند 3,700 دورة في الدقيقة. قم بإجراء التجانس باستخدام 10 مل من الملاط ومطحنة مناديل المدقة. بين تجانس كل عينة على حدة ، قم بتنظيف المدقة باستخدام 70٪ من الإيثانول.
ملاحظه: يجب أن تكون ضربات التجانس متسقة من حيث السرعة والحجم.
- صب التجانس في أنابيب الطرد المركزي المسماة.
< p class = "jove_title" >
4. خطوات الطرد المركزي
- أضف 8.0 مل من محلول ديكستران بنسبة 26٪ إلى كل أنبوب طرد مركزي مصنف يحتوي على تجانس الدماغ.
- اقلب الأنبوب مرتين ثم قم بتدوير العينة جيدا. قم بإجراء دوامة كل عينة باستخدام زوايا متعددة لضمان خلط شامل لمحلول تجانس الدماغ مع محلول ديكستران بنسبة 26٪.
- عينات أجهزة الطرد المركزي عند 5,000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية < br / >
ملاحظه: بالنسبة لبعض التحليلات ، من المفيد مقارنة الأوعية الدقيقة في الدماغ مع حمة الدماغ. إذا كان تقييم التعبير البروتيني في حمة الدماغ مطلوبا ، فيمكن جمع المادة الطافية من خطوة الطرد المركزي هذه (أي الجزء المتني في الدماغ) وتخزينها عند -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.
- قم بإزالة المادة الطافية باستخدام شفاط فراغ وماصة باستور زجاجية.
ملاحظه: يجب توخي الحذر حتى لا تزعج الحبيبات. خلاف ذلك ، سيتم تقليل كمية الأوعية الدقيقة للدماغ التي تم جمعها ، مما سيقلل بشكل كبير من إنتاج البروتين من هذا الإجراء.
- أعد تعليق الحبيبات في 5.0 مل من كوكتيل مثبط البروتياز المحتوي على BMB (أي كوكتيل مثبط البروتياز 1.0 ميكرولتر لكل 1.0 مل من المخزن المؤقت BMB). دوامة الحبيبات لضمان الخلط الشامل.
- أضف 8.0 مل من ديكستران بنسبة 26٪ إلى كل أنبوب ودوامة للطرد المركزي كما هو موضح في الخطوات 4.1-4.2 من هذا البروتوكول.
- عينات أجهزة الطرد المركزي عند 5,000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
- باستخدام قارورة مفرغة وماصة زجاجية ، قم بشفط المادة الطافية وتأكد من عدم تعطل الحبيبات التي تحتوي على وعاء الدماغ.
ملاحظه: لا تحتوي المواد الزائدة التي تلتصق بجدار الأنبوب على أوعية دقيقة ويجب تنظيفها وإزالتها بعناية.
- كرر الخطوات من 4.5 إلى 4.8 مرتين إضافيتين.
- بمجرد الانتهاء من 4 خطوات للطرد المركزي ديكستران ، أضف 5.0 مل من BMB إلى كل حبيبات ودوامة لإعادة تعليق العينة.
ملاحظه: بعد الانتهاء من الخطوة 4.10 ، يمكن جمع الأوعية الدقيقة الكاملة لتحليل توطين البروتين. يمكن تحقيق ذلك عن طريق أخذ 50 ميكرولتر من حبيبات الأوعية الدقيقة المعاد تعليقها وتلطيخها على شريحة مجهر زجاجي. ثم يتم تثبيت الأوعية الدقيقة بالحرارة عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق على كتلة تسخين ، متبوعا بالتثبيت في الإيثانول المثلج لمدة 10 دقائق إضافية. يمكن بعد ذلك تخزين الشرائح عند 4 درجات مئوية حتى تكون مطلوبة لدراسات التصوير.
