تحضير شرائح القولون والثلاموقر من دماغ جرو الفأر

الملخص

المصدر: Slater، B.J.، et al.، تعديل شريحة دماغ الفأر القوصية المغمورية ، والتي تتضمن الطباعة ثلاثية الأبعاد لمكونات الغرفة والتصوير البصري متعدد المقاييس. J. Vis. Exp. (2015)

يوضح الفيديو تحضير شرائح الدماغ القولونية المهادية القشرية من أدمغة جرو الفأر. يتم محاذاة الدماغ المعزول على شريحة ملحوظة ويتم قصها بزاوية لمحاذاة الدماغ المتوسط السمعي والدماغ الأمامي في نفس المستوى. ثم يتم تقطيع الدماغ باستخدام اهتزاز ، ويتم نقل الشرائح التي تحتوي على هياكل الدماغ المتوسط السمعي الرئيسية والدماغ الأمامي إلى غرفة احتجاز للحفظ.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

< p class = "jove_title" >1. التحضير لإزالة الدماغ من الفأر للتقطيع

1. استعد للتروية وحضانة الشرائح.
   1. قبل التقطيع بحوالي 30 دقيقة ، قم بإعداد محلول قطع عالي السكروز والسائل النخاعي الاصطناعي منخفض الكالسيوم (aCSF) لاحتضان الشريحة قبل التسجيل أو التصوير.
   2. ضع جميع الأدوات اللازمة (مقص نهاية حادة كبير ، مقص زنبركي صغير ، ملقط تشريحي ، مقص كبير أو مقصلة ، مقص قزحية ، ملقط مجوهرات ، حقنة 10 مل مع إبرة 27 جم × 1/2 بوصة ، قطعة صغيرة من ورق الترشيح 1 سم × 2 سم ، وماصة باستور مكسورة لنقل الشرائح) للنضح والتقطيع ، وإعداد صينية التروية.
   3. قم بإعداد غرفة حضانة مع aCSF المؤكسج في حمام مائي بدرجة حرارة 32 ^درجةمئوية وطبق ثقافة مملوء بمحلول القطع.
2. تحضير مرحلة القطع للتقطيع.
   1. قم بقص قطعة صغيرة من أجار 3٪ تقريبا 1 سم³ لاستخدامها كدعم للدماغ و 1.5 سم × 1.5 مم × 3 مم لاستخدام نتوء لدعم القولون السفلي (IC).
   قم
   2. بلصق الدعامة على المسرح باستخدام مادة لاصقة cyanoacrylate بالإضافة إلى النتوء الموجود على الجانب الأيمن من الدعامة بحيث تشكل زاوية 80^درجة.
3. إزالة الدماغ.
   1. تخدير بعمق في يوم ما بعد الولادة 12- يوم ما بعد الولادة 20 (p12-p20 ، من الناحية المثالية p14-18) الفأر بالكيتامين 100 مجم / كجم والزيلاكسين 3 مجم / كجم (أو إجراء معتمد من لجنة الأخلاقيات المماثلة).
      ملاحظه: تأكد من مستوى التخدير المناسب من خلال عدم الاستجابة لقرص إصبع القدم. نظرا لأن يخضع للتخدير لفترة وجيزة ، فإن مرهم العيون غير ضروري.
   2. باستخدام مقص نهاية حادة ، قم بتعريض القفص الصدري من عملية الخنجري إلى الرقبة.
      1. ابحث عن عملية الخنجري ، وقم بعمل قطع أفقي بحوالي 1.5 سم.
      2. قم بعمل قطعتين رأسيتين من نهايات القطع الأفقي السابق إلى الكتفين ، حوالي 1.5 سم لكل منهما.
   3. اقطع الحجاب الحاجز والوصلات الضلعية لكشف القلب.
   4. باستخدام مقص زنبركي صغير ، قم بعمل قطع صغير بحجم 2-5 مم في الأذين الأيمن ، من الجانب البطني إلى الجانب الظهري من القلب.
   5. باستخدام حقنة سعة 10 مل بإبرة 27 جم × 1/2 بوصة ، قم بحقن البطين الأيسر وقم بتغذية بسرعة بمحلول قطع عالي السكروز.
   6. بمجرد أن يصبح الدم صافيا ، استخدم مقصا أكبر لإزالة الرأس.
      ملاحظه: لم نقم بتقييم فائدة التروية بشكل منهجي. ومع ذلك ، في تجربتنا ، يمكن إجراء التروية عبر القلب في الفئران بهذا الشباب بنجاح يقارب 100٪ ، وله فائدة في القضاء على خلايا الدم الحمراء ، والتي يمكن أن تتألق وتتداخل مع التصوير.
   7. قطع الجلد أسفل خط الوسط لكشف الجمجمة.
   8. باستخدام مقص القزحية المثني ، اقطع الجمجمة بين العينين ، ثم ابدأ من القطع بين العينين ، وقم بقصه بعناية من الأمام إلى الخلفي على طول خياطة خط الوسط مع الحرص على عدم إتلاف الدماغ تحتها.
      ملاحظه: عادة ما تؤتي الجافية بالجمجمة. إذا لزم الأمر ، قم بإزالة الجافية قبل إزالة الدماغ بعناية.
   9. باستخدام ملقط المجوهرات ، افتح الجمجمة وقم بإزالة الدماغ بعناية ، ثم ضع الدماغ في محلول القطع. احرص على تجنب إتلاف القشرية.

< p class = "jove_title" >2. تحضير الدماغ للتقطيع

1. تحضير الدماغ للتركيب على مرحلة الاهتزاز.
   1. باستخدام شريحة مميزة بخطرين عند 90^درجة وخط قطري عند 17^درجة من أعلى اليسار إلى أسفل اليمين ، تتقاطع مع مكان التقاء الخطين ، ضع الجانب الظهري للدماغ لأعلى ، باستخدام شفرة حلاقة ، قم بإزالة 2-4 مم من الدماغ النهائي المنقاري مما يخلق سطحا مستويا.
   2. ضع الجانب الذيلي للدماغ لأعلى على السطح المسطح الذي تم إنشاؤه حديثا ، وقم بمحاذاة السطح الظهري للدماغ مع الخط الأفقي والخط الأوسط للدماغ مع الخط الرأسي.
   3. قم بمحاذاة شفرة الحلاقة مع خط 17^درجة ، وقم بإمالة ماكينة الحلاقة بزاوية 30^درجة وقم بإزالة ما يقرب من 3 مم من القشرة اليمنى في قطع قطري مزدوج (17^درجة من المستوى الأفقي و 60^درجة من الإكليلية).
2. تصاعد الدماغ على مرحلة الاهتزاز.
   1. ضع قطعة صغيرة من ورق الترشيح 1 سم × 2 سم على الجانب البطني من الدماغ بحيث يكون البعد الطويل عموديا على خط الوسط.
   2. ضع كمية صغيرة من مادة لاصقة cyanoacrylate بعناية على المنطقة أمام الدعامة (وعلى يسار النتوء).
   3. ضع وجه الدماغ المزدوج المقطوع قطريا على الغراء بحيث يتم دعم الجزء الذيلي من الدماغ والدماغ الخلفي على النتوء والجانب الأيمن من الدماغ مقابل الدعامة.
   4. اضغط برفق على الدماغ ، مع التأكد من أن السطح بأكمله على اتصال بغرفة التقطيع.

< p class = "jove_title" >3. الحصول على شريحة القولون المهاد القشري

1. خذ مرحلة القطع بسرعة وضعها في الاهتزاز ، واملأ المرحلة بمحلول القطع.
2. قم بمحاذاة الشفرة مع الجزء العلوي (الجانب البطني) من الدماغ.
3. قم بإزالة 1-1.5 مم من أعلى الدماغ ، وقم بإزالة شرائح 300-500 ميكرومتر وتقييم العمق بعد الإزالة.
   ملاحظة: عندما يكون IC والجسم الركبي الإنسي (MGB) والنواة الركبية الجانبية (LGN) كلها مرئية ، ويشكل التلفيف المسنن شكل "C" يأخذ شريحة إلى شريحتين 600 ميكرومتر. انظر الشكل 1 أ.
4. ضع الشرائح في غرفة التثبيت الساخنة (32 ^درجةمئوية).

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1. تصوير التألق الذاتي للبروتين الفلافوبروتين لشريحة الدماغ القولونية المهاد القشري.(أ) شريحة دماغ القولون المهاد القشرية المتصلة كما أكدها التألق الذاتي للبروتين الفلافو. التحفيز الكهربائي عند 0.05 هرتز من IC تم تصويره عند 4 هرتز ومعالجة فورييه لإظهار القوة عند تردد التحفيز. لاحظ تنشيط MGB والنواة الشبكية المهادية (TRN) والقشرة السمعية (AC) وكذلك الجسم المخطط (CS...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات محلول قطع السكروز العالي في المليمتر: 206 سكروز ، 10.0 ملغم كلوريد₂ ، 11.0 جلوكوز ، 1.25 هيدروهيدرات_{هيدروكسيد هيدروكسيد 2}PO4 ، 26 هيدروكلوريد الصوديوم₃ ، 0.5 كلوريد المكالسيوم₂ ، 2.5 كيلو كلوريد ، درجة الحموضة 7.4 انخفاض الكالسيوم aCSF في الملي: 126 كلوريد الصوديوم ، 3.0 ملجمكلوريد₂ ، 10.0 جلوكوز ، 1.25 هيدروكلوريد_{هيدروكسيد 2}PO₄ ، 26 NaHCO₃ ، 1.0 CaCl₂ ، 2.5 كيلو كلوريد ، درجة الحموضة 7.4 aCSF في الملي: 126 كلوريد الصوديوم ، 2.0 ملغ كلوريد₂ ، 10.0 جلوكوز ، 1.25 هيدروكسيد_{هيدروكسيد 2}PO₄ ، 26 NaHCO₃ ، 2.0 كلوريد المكلون₂ ، 2.5 كيلو كلوريد ، درجة الحموضة 7.4 DMSO تقنيات الحياة د12345 الكمية: 1572C502 طبق ثقافة كبير فيشربراند 08-757-13 طبق ثقافة 100 × 15 مم طبق ثقافة صغير صقر 353001 طبق ثقافة 35 × 10 مم غشاء ثقافة مرتفع ميليسيل PICMORG50 تستخدم للحفاظ على نضح السوائل المؤكسجة على جانبي الشريحة. أجار لحجب الدماغ 3٪ من الوزن في الماء