الحث في المختبر للوصلات العصبية العضلية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان

الملخص

المصدر: Lin، C. et al. ، في المختبر الوصلة العصبية العضلية المستحثة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة عن طريق الإنسان. J. Vis. Exp.(2020).

توضح هذه التجربة بالتفصيل طريقة لتوليد الوصلات العصبية العضلية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان. يستخدم عملية تمايز مرحلية لتعزيز تطور الخلايا العصبية العضلية والحركية وتكوين المشبك ، مما ينتج عنه تقاطعات عصبية عضلية وظيفية.

البروتوكول

فئة

1. تحضير الألواح المطلية بالمصفوفة خارج الخلية (ECM)

1. تمييع ECM (انظر جدول المواد) مع الثلج البارد 1x PBS إلى تركيز نهائي قدره 2٪
2. أضف 1 مل من ECM إلى 49 مل من 1x PBS في أنبوب بلاستيكي سعة 50 مل. تخلط جيدا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل عدة مرات.
3. ضع 1 غطاء في كل بئر من 6 آبار. أضف 1.5 مل من 2٪ ECM في كل بئر.
4. احتضان لوحة البئر مع 2٪ ECM لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية.
5. قم بشفط ECM من لوحة البئر وقم بتخزين اللوحة عند 4 درجات مئوية قبل الاستخدام.

< ص الفئة = "jove_title">2. تمايز iPSCs نحو NMJ

1. بذرة 4 × 10⁵ من iPSCs لكل بئر على لوحة 6 آبار أعدت في القسم 1. تأكد من زرع الخلايا الموجودة على الغطاء المودعة مسبقا في البئر.
   ملاحظه: في هذه الدراسة ، تم استخدام خط خلايا 201B7^MYOD iPS.
   1. إزالة الوسط من iPSCs على 6 سم صحن الثقافة وغسل iPSCs مرة واحدة مع 1x PBS.
   2. أضف 1 مل من محلول انفصال الخلايا إلى الطبق واحتضانه لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية.
   3. أضف 3 مل من وسط خلية الجذع الجنيني للرئيسيات (ES) إلى الطبق وقم بتقطيعه برفق 3 مرات.
   4. جمع طاف, الذي يحتوي على iPSCs منفصلة, في 50 مل أنبوب بلاستيكي وجهاز طرد مركزي عند 160 × ز عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
   5. شفط بعناية طاف, إعادة تعليق iPSCs في 3 مل الرئيسيات ES خلية وسط مع 10 ميكرومتر Y27632, وحساب عدد الخلية باستخدام مقياس الدم.
   6. تمييع iPSCs مع الرئيسيات ES خلية الوسط و 10 ميكرومتر Y27632 إلى تركيز 2 × 10⁵ خلايا/مل. إضافة 2 مل من iPSCs على قسيمة الغطاء المودعة مسبقا في البئر الموصوف في القسم 1.

< ص الفئة = "jove_title">3. تحريض iPSCs إلى NMJ

1. في اليوم 1, 24 ح بعد بذر iPSCs إلى لوحة 6 آبار, إزالة وسط الثقافة واستبداله مع 2 مل من الرئيسيات الطازجة ES خلية وسط تحتوي على 1 ميكروغرام/مل دوكسيسيكلين لكل بئر.
2. قم بتغيير الوسط ب 2 مل من وسط التمايز العضلي (MDM) (الجدول 1) الذي يحتوي على 1 ميكروغرام / مل دوكسيسيكلين (التركيز النهائي) لكل بئر. قم بتحديث الوسيط كل يوم من اليوم 2 إلى اليوم 10.
3. من اليوم 11 ، قم بتبديل الوسط إلى 2 مل من وسط NMJ (الجدول 1) إلى كل بئر. قم بتحديث الوسيط كل 3-20124 يوما بعد ذلك حتى اليوم 30.
4. لاحظ NMJ المتمايز عن طريق الفحص المجهري المقلوب الطور في اليوم 30. يمكن استخدام NMJ للتحليل التالي.

النتائج

الجدول 1: صيغة الوسيط.

وسط التمايز العضلي (MDM) ميم ألفا 500 مل 100 ميجا 2-ME 1117 ميكرولتر الدوكسيسيكلين 1 ميكروغرام / مل KSR 56 مل (نهائي إلى 10٪) ...

المواد