تقنية لحصاد وفصل العقد الجذرية الظهرية للثقافات العصبية

الملخص

المصدر: de Luca ، A. C. ، et al. ، الخلايا العصبية للعقد الجذرية الظهرية والخلايا الجذعية المشتقة من الدهون المتمايزة: نموذج للزراعة المشتركة في المختبر لدراسة تجديد الأعصاب الطرفية. J. Vis. Exp. (2015).

< p class = "jove_content" >يوضح هذا الفيديو طريقة لحصاد الخلايا العصبية من العقد الجذرية الظهرية (DRG). يتم عزل DRG من العمود الفقري للفئران ، ومعالجته بالإنزيمات ، ثم فصله ميكانيكيا للحصول على تعليق أحادي الخلية. يتم فصل الخلايا العصبية عن الخلايا الدبقية باستخدام الطرد المركزي المتدرج للكثافة ويتم زراعتها في وسط النمو.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

< p class = "jove_title" >1. الإعداد التجريبي

1. قبل البدء في حصاد الأنسجة والخلايا ، تأكد من أن جميع الأدوات معقمة. إذا لزم الأمر ، قم بالتعقيم بزوج من المقصات الجراحية الحادة ، وزوج من الملقط الناعم جدا ، وزوج من الملقط القياسي الدقيق. أيضا ، حسب الاقتضاء ، قم بتعقيم كل ركيزة قبل بذر الخلايا باستخدام التعقيم بالأشعة فوق البنفسجية أو التعرض للإيثانول أو التعقيم بالبخار.
2. تحضير الوسائط وحلول المخزون لحصاد الخلايا العصبية وتفكيكها
   1. قم بإعداد وسط بوتنشتاين وساتو (BS) ، عن طريق إضافة 1٪ بنسلين ستربتومايسين (PS) و 1٪ مكمل N2 ....

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مصفاة خلية 100 ميكرومتر BD Biosciences هاتف: 352360 يمكن استخدام مصافي 70 ميكرومتر (المرجع 352350) كبديل أنابيب بلاستيكية 15 مل سارستيدت 62.554.002 50 مل أنابيب بلاستيكية سارستيدت 62.547.004 75 سم² قوارير كورنينج BC301 ألبومين مصل الأبقار (BSA) سيغما أ 9205 الكولاجيناز النوع الرابع ورثينجتون بيوكيمياء LS004188 ملاحظة: يستخدم هذا الكولاجيناز فقط لفصل مستخرجات DRG مصل الأبقار الجنيني (FBS) بيوسيرا FB-1001 الماصات الزجاجية فيشر ساينتيك FB50253 المواد الحادة التي يجب التخلص منها وفقا لذلك مزيج المغذيات F12 لحم الخنزير سيغما N6658 يسخن عند 37 درجة مئوية في حمام مائي ما لم ينص على ذلك محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS) سيغما H9394 يسخن عند 37 درجة مئوية في حمام مائي ما لم ينص على ذلك ملحق N-2 (100x) إنفيتروجين 17502 بروتين عامل نمو الأعصاب 2.5 ثانية ، الغدد تحت الفكين الفكية للفأر (NGF) ميليبور NC011 البنسلين الستربتومايسين (PS) سيغما P0781 أطباق بتري كورنينج 430165 التربسين (2x بنكرياس بقري) ورثينجتون بيوكيمياء LS003703 يستخدم هذا لتفكك DRG