تقنية لحصاد وفصل العقد الجذرية الظهرية للثقافات العصبية

الملخص

المصدر: de Luca ، A. C. ، et al. ، الخلايا العصبية للعقد الجذرية الظهرية والخلايا الجذعية المشتقة من الدهون المتمايزة: نموذج للزراعة المشتركة في المختبر لدراسة تجديد الأعصاب الطرفية. J. Vis. Exp. (2015).

< p class = "jove_content" >يوضح هذا الفيديو طريقة لحصاد الخلايا العصبية من العقد الجذرية الظهرية (DRG). يتم عزل DRG من العمود الفقري للفئران ، ومعالجته بالإنزيمات ، ثم فصله ميكانيكيا للحصول على تعليق أحادي الخلية. يتم فصل الخلايا العصبية عن الخلايا الدبقية باستخدام الطرد المركزي المتدرج للكثافة ويتم زراعتها في وسط النمو.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

< p class = "jove_title" >1. الإعداد التجريبي

1. قبل البدء في حصاد الأنسجة والخلايا ، تأكد من أن جميع الأدوات معقمة. إذا لزم الأمر ، قم بالتعقيم بزوج من المقصات الجراحية الحادة ، وزوج من الملقط الناعم جدا ، وزوج من الملقط القياسي الدقيق. أيضا ، حسب الاقتضاء ، قم بتعقيم كل ركيزة قبل بذر الخلايا باستخدام التعقيم بالأشعة فوق البنفسجية أو التعرض للإيثانول أو التعقيم بالبخار.
2. تحضير الوسائط وحلول المخزون لحصاد الخلايا العصبية وتفكيكها
   1. قم بإعداد وسط بوتنشتاين وساتو (BS) ، عن طريق إضافة 1٪ بنسلين ستربتومايسين (PS) و 1٪ مكمل N2 إلى وسط Ham's F12. احسب الحجم النهائي المطلوب على أنه 500 ميكرولتر لكل بئر (إذا كنت تستخدم صفيحة 24 بئرا).
   2. تحضير مخزون الكولاجيناز IV في وسط Ham's F12 بتركيز 1.25٪ بالوزن / الحجم. قم بتصفية المحلول وتعقيمه وتخزينه عند -20 درجة مئوية مثل 200 ميكرولتر من الحصص الصغيرة.
   3. تحضير مخزون التربسين البنكرياس البقري في وسط هام F12 بتركيز 2.5٪ بالوزن / حجم ، وتعقيم الترشيح وتخزينه في -20 درجة مئوية مثل 200 ميكرولتر من الحصص
   4. تحضير محلول مخزون عامل نمو الأعصاب (NGF) بتركيز 5 ميكروغرام / مل في محلول ألبومين مصل الأبقار البقري الخالي من الأحماض الدهنية (BSA) المعقم بالترشيح 1 مجم / مل في وسط F12 وتخزينه عند -20 درجة مئوية مثل 200 ميكرولتر من الحصص لا تقم بتصفية NGF بعد إعادة التشكيل.
3. في حالة عدم إجراء تعديل على السطح ، قم بتغطية / ألواح الطلاء ب poly-D-lysine (0.1 مجم / مل لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة [RT]) و / أو اللامينين (2-10 ميكروغرام / سم² لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية) لدعم ارتباط الخلايا العصبية ونمو العصبية حسب الاقتضاء.
قم
4. دائما بتسخين الوسائط في حمام مائي عند 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.

< p class = "jove_title" >2. حصاد وتفكك الخلايا العصبية للعقد الجذرية الظهرية (DRG)

1. إنهاء الجرذ عن طريق خلع عنق الرحم وقطع الرأس. احلق الجرذ وارفع الجلد لكشف العمود الفقري. باستخدام مقص حاد ، قم باستئصال العمود الفقري مع العناية الإضافية بالأعضاء والأوعية الدموية المحصورة. انقل العمود الفقري في خزانة السلامة البيولوجية (الفئة الثانية) باستخدام طبق بتري وقم بإزالة أي جزء ظهري.
2. قسم العمود الفقري إلى نصفين على طول المحور الطولي باستخدام مقص جراحي معقم وحاد لكشف أنسجة الحبل السري. في هذه المرحلة ، من المفيد قطع العمود الفقري إلى جزأين أصغر تحت مستوى القفص الصدري ، لتسهيل التعامل معه أثناء حصاد الخلايا العصبية DRG. باستخدام ملقط دقيق ، قم بإزالة جميع أنسجة الحبل السري برفق ، مع الانتباه إلى عدم سحب وإزالة جذور DRG. بهذه الطريقة سيتم الكشف عن DRG والجذور داخل القنوات الفقرية ، والتي لا تزال مغلفة في العمود. لاحظ DRG على أنها خيوط بيضاء تخرج مباشرة من القنوات.
3. اسحب جذر DRG بالكامل (وليس DRG فقط) من القنوات الفقرية باستخدام ملقط دقيق جدا ، والتعمق في القنوات الفقرية والانتباه إلى عدم إتلاف جذور العقد. انقل DRG إلى طبق بتري صغير (60 مم²) يحتوي على 3-4 مل من وسط Ham's F12 مكمل بنسبة 1٪ PS. إذا كنت تستخدم مختلفة ، فاستخدم أطباق منفصلة.
4. تحت مجهر تشريح ، قم بتنظيف DRG من أي فائض من جذور الأعصاب المحيطة بالعقد باستخدام ملقط معقم ومشرط لتقليل تلوث الخلايا الدبقية. انقل DRG إلى طبق بتري صغير (35 مم²) مع 1.8 مل من وسط F12 الطازج.
5. أضف 200 ميكرولتر من محلول مخزون الكولاجيناز من النوع الرابع 1.25٪ بالوزن / الحجم) (التركيز النهائي 0.125٪) واحتضان DRG عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2} لمدة ساعة واحدة. أضف وسط F12 الطازج المكمل بإنزيم الكولاجيناز من النوع الرابع بنسبة 0.125٪ بالوزن / الحجم، واحتضنه لمدة ساعة واحدة كما هو موضح سابقا.
6. قم بشفط الوسط وغسل DRG برفق باستخدام وسيط F12. أضف بعد ذلك 1.8 مل من F12 المتوسط و 200 ميكرولتر من التربسين (التركيز النهائي 0.25٪ بالوزن / الحجم) واحتضنه عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 30 دقيقة.
7. قم بإزالة التربسين وأضف 1 مل من وسط F12 المكمل ب 500 ميكرولتر من مصل الأبقار الجنينية (FBS) لإيقاف التفاعل الأنزيمي. قم بشفط الوسط وغسل DRG برفق باستخدام وسط F12 لمدة ثلاث مرات لإزالة آثار المصل.
8. أضف 2 مل من وسط F12 الطازج وانقل DRG بحذر مع الوسط إلى أنبوب سعة 15 مل باستخدام ماصة زجاجية. قم بفصل الخلايا العصبية DRG برفق عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل (حوالي 8-10 مرات) باستخدام الماصة الزجاجية (يمكن استخدام الأطراف البلاستيكية كبديل).
9. اسمح للحبيبات بالاستقرار في قاع الأنبوب وجمع الوسط في أنبوب جديد. أضف 2 مل من وسط F12 الطازج إلى الأنبوب الذي يحتوي على الحبيبات وكرر التفكك الميكانيكي مع الماصة الزجاجية. كرر هذه الخطوة حتى يصبح التعليق متجانسا (حوالي 3-4 مرات) واجمع كل DRG المنفصل في الأنبوب الجديد. تقلل هذه الطريقة من الإجهاد الناتج عن التفكك الميكانيكي وتحسن صلاحية الخلايا العصبية.
10. قم بتصفية التعليق المتجانس الناتج في أنبوب جديد سعة 15 مل باستخدام مصفاة خلية 100 ميكرومتر لإزالة الخلايا العصبية غير المنفصلة وغيرها من الحطام. في هذه المرحلة ، قد يكون من الملائم أولا تصفية معلق الخلية في أنبوب سعة 50 مل ثم نقل المحلول إلى الأنبوب الأصغر باستخدام ماصة زجاجية. جهاز طرد مركزي التعليق عند 110 جم لمدة 5 دقائق.
11. قم بإعداد BSA بنسبة 15٪ عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من محلول BSA بنسبة 30٪ إلى 500 ميكرولتر من وسط F12. قم بسحب المحلول ببطء أسفل جدار أنبوب سعة 15 مل لإنشاء مسار بروتين تدريجي. في هذه المرحلة ، من المفيد إمساك الأنبوب بزاوية 45 درجة وتحرير BSA ببطء باستخدام الأرقام الموجودة على أنبوب الصقر كمرجع ل "المسار" المتكون.
12. قم بشفط المادة الطافية من الخطوة 2.10 مع ترك 500 ميكرولتر في قاع الأنبوب وإعادة تعليق حبيبات الخلية في نفس الوسط. قم بسحب المعلق ببطء على طول مسار البروتين المعد مسبقا في الخطوة 2.11 (استخدم الأرقام الموجودة على الأنبوب كمرجع) وجهاز الطرد المركزي عند 500 جم لمدة 5 دقائق.
13. شفط المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من وسط BS المعدل.
    ملاحظه: يمكن تكوين حجم إعادة تعليق الخلايا العصبية DRG إلى الحجم الفعلي المطلوب ، اعتمادا على تركيز الخلية النهائي المطلوب وعدد العينات المراد زرعها. سيوفر واحد خلايا كافية لتجربة لوحة 24 بئرا.
14. احتضان العينات المصنفة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة ساعتين للسماح بربط الخلية وأخيرا إضافة وسط BS جديد مكمل ب 50 نانوغرام / مل من NGF.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مصفاة خلية 100 ميكرومتر BD Biosciences هاتف: 352360 يمكن استخدام مصافي 70 ميكرومتر (المرجع 352350) كبديل أنابيب بلاستيكية 15 مل سارستيدت 62.554.002 50 مل أنابيب بلاستيكية سارستيدت 62.547.004 75 سم² قوارير كورنينج BC301 ألبومين مصل الأبقار (BSA) سيغما أ 9205 الكولاجيناز النوع الرابع ورثينجتون بيوكيمياء LS004188 ملاحظة: يستخدم هذا الكولاجيناز فقط لفصل مستخرجات DRG مصل الأبقار الجنيني (FBS) بيوسيرا FB-1001 الماصات الزجاجية فيشر ساينتيك FB50253 المواد الحادة التي يجب التخلص منها وفقا لذلك مزيج المغذيات F12 لحم الخنزير سيغما N6658 يسخن عند 37 درجة مئوية في حمام مائي ما لم ينص على ذلك محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS) سيغما H9394 يسخن عند 37 درجة مئوية في حمام مائي ما لم ينص على ذلك ملحق N-2 (100x) إنفيتروجين 17502 بروتين عامل نمو الأعصاب 2.5 ثانية ، الغدد تحت الفكين الفكية للفأر (NGF) ميليبور NC011 البنسلين الستربتومايسين (PS) سيغما P0781 أطباق بتري كورنينج 430165 التربسين (2x بنكرياس بقري) ورثينجتون بيوكيمياء LS003703 يستخدم هذا لتفكك DRG