تعزيز تمايز الخلايا الجذعية من خلال علاج DMSO العابر

الملخص

المصدر: Sambo ، D. et al. ، المعالجة العابرة للخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات باستخدام DMSO لتعزيز التمايز. J. Vis. Exp. (2019)

يوضح هذا الفيديو طريقة تعزيز تمايز الخلايا الجذعية من خلال علاج DMSO العابر ، والذي يقبض على الخلايا في مرحلة G1. بعد العلاج ، تتم إضافة وسيط تمايز الأديم الظاهر مع مثبطات BMP و TGF-β لتعزيز تكوين السلائف العصبية.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. صيانة الخلايا الجذعية

ملاحظة: ينطبق بروتوكول صيانة الخلية الموضح أدناه على الخلايا الجذعية متعددة القدرات (PSCs) التي يتم الاحتفاظ بها في طبقة أحادية ملتصقة. يمكن تعديل الوسائط والكواشف الأخرى وألواح زراعة الخلايا المستخدمة قبل معالجة ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) حسب الحاجة. بالنسبة لجميع البروتوكولات التالية في هذه المخطوطة ، يجب التعامل مع الخلايا تحت خزانة السلامة البيولوجية.

1. قم بتغطية الألواح المعقمة ، 6 الآبار ، المعالجة بزراعة الأنسجة مع مصفوفة أو ركيزة متعددة القدرات مؤهلة للخلايا الجذعية معدة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وتحتضن لمدة ساعة واحدة على الأقل في حاضنة ثاني أكسيد الكربون₂ (5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ ، جو رطب). يمكن لف الألواح المطلية وتخزينها عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
2. قم بإذابة PSCs المحفوظة بالتبريد في حمام مائي 37 درجة مئوية. قم بتعقيم القارورة بالإيثانول قبل إدخالها إلى خزانة السلامة البيولوجية ، ثم انقل الخلايا على الفور عن طريق سحب العينة إلى أنبوب مخروطي معقم يحتوي على 5-10 أحجام من وسائط الخلايا الجذعية الدافئة مسبقا.
3. الطرد المركزي للخلايا عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
4. قم بشفط الوسائط وأعد تعليق حبيبات الخلية برفق في 1 مل من وسائط الخلايا الجذعية المكملة بمثبط بروتين كيناز (ROCK) المرتبط ب 10 ميكرومتر ، مثل Y-27632.
5. استنشق مصفوفة الثقافة من الصفيحة وبذر الخلايا بالكثافة المطلوبة ، عادة 0.5-1 × 10⁶ خلايا لكل بئر في 2 مل على الأقل من وسائط الخلايا الجذعية لكل بئر.
   ملاحظه: يمكن أن تختلف كثافة الطلاء عبر خطوط الخلايا المختلفة والنسخ ويجب تحسينها وفقا لذلك.
6. الحفاظ على الخلايا عن طريق استبدالها بوسائط الخلايا الجذعية الدافئة مسبقا يوميا. قم بتقسيم الخلايا عند التقاء 70٪ -80٪ تقريبا أو عندما تبدأ مستعمرات الخلايا في الاتصال.
7. لتقسيم الخلايا ، قم بشفط الوسائط وغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS). احتضان الخلايا ب 1 مل من محلول إنزيم التفكك لكل بئر لمدة 5-10 دقائق عند 37 درجة مئوية.
8. اغسل الخلايا وأعد تعليقها بوسائط الخلايا الجذعية الدافئة مسبقا وانقلها إلى أنبوب مخروطي معقم به 5-10 أحجام من وسائط الخلايا الجذعية. اتبع الخطوات 1.3-1.7 للوحة الخلايا.

< p class = "jove_title" >2. المعالجة المسبقة DMSO

ملاحظة: عند طلاء الخلايا للمعالجة المسبقة DMSO قبل التمايز ، يجب تحسين كثافة خلايا الطلاء الأولية مع مراعاة معدل النمو النموذجي لخط الخلايا الجذعية بالإضافة إلى بروتوكول التمايز المستخدم. التحقق من صحة تعدد القدرات باستخدام العلامات التقليدية ، حسب الضرورة. يجب تمرير الخلايا 1x-2x على الأقل بعد الذوبان الأولي قبل التمايز.

1. تمايز ثقافة 2D
   1. عندما تصل الخلايا إلى التقاء مناسب ، قم بإعداد الألواح المطلية ، وفصل الخلايا ، وإعداد معلق أحادي الخلية كما هو موضح أعلاه.
   2. عد الخلايا الحية باستخدام مقياس كثافة الدم أو عداد الخلايا الأوتوماتيكي بما في ذلك التريبان الأزرق أو علامة بقاء أخرى.
   3. ضع الخلايا على صفيحة مغلفة من 6 آبار عند 0.5-1 × 10⁶ خلايا لكل بئر في وسائط الخلايا الجذعية باستخدام مثبط ROCK 10 ميكرومتر. < / > ملاحظة: بالنسبة لخطوط الخلايا التي تم اختبارها في مختبرنا ، أدت هذه الكثافات عادة إلى 80٪ -90٪ من الخلايا المتجمعة ضمن المعالجة المسبقة ل DMSO لمدة 24 ساعة.
   4. اسمح للخلايا بالتحضين لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون₂ (5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ ، جو رطب).
   5. قم بإعداد 1٪ -2٪ DMSO في وسائط الخلايا الجذعية الدافئة مسبقا (على سبيل المثال ، 100 ميكرولتر من DMSO في 10 مل من الوسائط = 1٪ محلول DMSO ، أو 200 ميكرولتر DMSO في 10 مل من الوسائط = 2٪ محلول DMSO).
   6. بعد 24 ساعة من الحضانة ، قم بشفط الوسائط من الخلايا واستبدلها بمحلول DMSO.
   7. اسمح للخلايا بالتحضين لمدة 24 ساعة إلى 48 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون₂ (5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ ، جو رطب) قبل التمايز. < / > ملاحظة: عادة ما يكون علاج DMSO لمدة 24 ساعة كافيا عبر غالبية خطوط الخلايا الجذعية الجنينية البشرية والمستحثة (ESC و iPSC). يمكن أن تستفيد خطوط الخلايا ذات معدلات النمو البطيئة جدا (أوقات المضاعفة الطويلة) من الحضانة لمدة 48 ساعة مع DMSO. بالنسبة للحضانة لمدة 48 ساعة مع DMSO ، يمكن استبدال الوسائط بوسائط الخلايا الجذعية الجديدة مع 1٪ -2٪ DMSO بعد أول 24 ساعة من العلاج.

< p class = "jove_title" >3. التمايز إلى الطبقات الجرثومية الأولية

ملاحظة: يصف ما يلي الطرق التي ثبت سابقا أنها فعالة في مختبرنا لمركبات PSCs المزروعة في طبقة أحادية على 6 ألواح آبار. يجب استخدام أي بروتوكول تمايز مفضل بعد علاج DMSO لتعزيز التمايز إلى السلالات المرغوبة. قم بإزالة محلول DMSO بعد علاج لمدة 24-48 ساعة واستمر في التمايز باتباع البروتوكولات القياسية.

1. تمايز الأديم الظاهر
   1. معالجة الخلايا باستخدام DMSO كما هو موضح أعلاه للثقافات ثنائية الأبعاد.
   2. تحضير حلول مخزون Noggin و SB431542.
   3. تحضير الوسائط الأساسية للتمايز الأديم الظاهر عن طريق إذابة بدائل المصل بالضربة القاضية (KOSR) إلى تركيز نهائي بنسبة 10٪ في وسط النسر المعدل من Dulbecco بالضربة القاضية (DMEM).
      ملاحظه: قم بإعداد وسائط أساسية كافية لمدة 3-4 أيام من تغيير الوسائط.
   4. تحضير وسط تمايز الأديم الظاهر عن طريق إضافة Noggin إلى تركيز نهائي قدره 500 نانوغرام / مل و SB431542 إلى تركيز نهائي قدره 10 ميكرومتر إلى الحجم المناسب من KOSR / Knockout DMEM.
   5. بعد المعالجة المسبقة ل DMSO ، قم بشفط الوسائط من الخلايا واستبدلها بوسائط التمايز (على سبيل المثال ، 2 مل لكل بئر من لوحة 6 آبار).
   6. اسمح للخلايا بالحضانة لمدة 3-4 أيام عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون₂ (5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ ، جو رطب) ، واستبدال الوسائط يوميا بعوامل تمايز مضافة حديثا.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 6-Well Clear Flat Bottom معالج TC لوحة ثقافة الخلايا متعددة الآبار كورنينج 353046 عداد الخلايا الآلي للكونتيسة الثانية FL ثيرمو فيشر العلمي AMQAF1000 DMEM / F-12 جيبكو 11320033 DMSO سيجما ألدريتش د2650 خروج المغلوب DMEM جيبكو 10829018 استبدال مصل خروج المغلوب جيبكو 10828028 ماتريكيل ماتريكس كورنينج 354277 Noggin Fc Chimera Protein أنظمة البحث والتطوير 3344-نغ-050 SB431542 ستيمجنت 04-0010 لوحات دقيقة مرفقة منخفضة للغاية كورنينج 3471 Y-27632 تقنيات الخلايا الجذعية 72302