$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.
1. إعداد المخازن المؤقتة للتشريح ووسائط الثقافة
- لعزل الحبل الشوكي للفئران ، قم بإعداد 100 مل من المخزن المؤقت للتشريح (1x PBS + 0.6٪ جلوكوز + 2٪ بنسلين - ستربتومايسين) وضعه في الثلاجة.
- تحضير 100 مل متوسطة خالية من السيروم (SFM) ودفئها عند 37 درجة مئوية. لتحضير SFM ، أضف 2 ملي من L-glutamine و 100 ميكروغرام / مل من البنسلين والستربتومايسين و 2٪ B27 و 10٪ مزيج هرموني إلى وسط Neurobasal-A. لتحضير مزيج هرموني ، اصنع وسيطا 1: 1 DMEM / F12 يحتوي على 0.6٪ جلوكوز ، و 3 ملي مولار NaHCO3 ، و 5 ملي مولار HEPES ، و 25 ميكروغرام / مل من الأنسولين ، و 100 ميكروغرام / مل apo-transferrin ، و 10 ميكرومتر بوتريسين ، و 30 نانومتر من السيلينيوم ، و 20 نانومتر من البروجسترون.
- قم بإعداد وسائط الطلاء المخصبة بعامل النمو EFH (أضف إلى SFM 20 نانوغرام / مل EGF و 20 نانوغرام / مل bFGF و 2 ميكروغرام / مل من الهيبارين) وقم بتسخينها عند 37 درجة مئوية.
< ص الفئة = "jove_title" >
2. حصاد وتشريح أنسجة الحبل الشوكي المحيط بالبطينين البالغة
- تعقيم أدوات التشريح في الإيثانول وشطفها في محلول ملحي معقم أو أدوات الأوتوكلاف مسبقا. أعط الفئران (6-8 أسابيع) حقنة قاتلة من البنتوباربيتال الصوديوم (1 سم مكعب عند 65 مجم / مل) أو جرعة زائدة من المخدر (أي 4٪ إيزوفلوران) وفقا لبروتوكول المعتمد من المؤسسة. غمر الجزء الخلفي من الجرذ بنسبة 70٪ من الإيثانول وإزالة الجلد الموجود على السطح الظهري بمقص تشريح كبير.
- أمسك المقص بشكل عمودي على السطح الظهري ، وقم بقطع العمود الفقري بشكل عرضي فوق الأطراف الخلفية. استخدم مقصا أصغر لقطع العضلة الظهرية التي تغطي العمود الفقري طوليا في اتجاه منقاري لفضح العمليات الشائكة.
- بدءا من الطرف الذيلي المكشوف ، أدخل الرونجور أو أداة قطع العظام الصغيرة غير الحادة خارج المحيط الجانبي للقناة الشوكية في الفراغ بين الحبل الشوكي والعمود الفقري. قم بعمل قطع صغيرة في الصفيحة (الأقواس العظمية إلى اليسار واليمين من العمليات الشائكة على كل جانب من الفقرات) وقم بتقشير الصفيحة بعناية لكشف الحبل الشوكي (الشكل 1A-D). تأكد من أن زاوية الشفرات ضحلة وموازية للحبل حتى لا يتلف الحبل الشوكي الأساسي.
- استمر في استئصال الصفيحة الفقرية في الاتجاه المنقاري لكشف الحبل الشوكي الصدري وعنق الرحم.
- استئصال الحبل الشوكي برفق من العمود الفقري باستخدام ملقط نسيجي غير حاد واستخدم مقص دقيق لقطع الجذور بعناية لتحرير الحبل. ضع الحبل الشوكي المستأصل في طبق بتري يحتوي على عازلة تشريح الفئران المعقمة 4 درجات مئوية (الموصوفة أعلاه في 1.1). اشطف المنديل في مخزن مؤقت حديث التحضير 4 درجات مئوية وقطع الحبل الشوكي بشكل عرضي إلى شرائح بحجم 1 سم باستخدام المقص (الشكل 1E).
- لكل جزء من الأنسجة ، استخدم إحدى يديك لإمساك الأنسجة بالملقط الدقيق. من ناحية أخرى ، استخدم المقص الدقيق لإزالة السحايا المغطى والمادة البيضاء ومعظم المادة الرمادية بعناية بمساعدة نطاق تشريح. بدلا من ذلك ، استخدم ملقطا دقيقا (Dumont # 4) لتقشير معظم المادة الرمادية والبيضاء ، تاركا فقط المنطقة المحيطة بالبطينين من الحبل الشوكي والتي تشمل البطانة العصبية وكمية صغيرة من المادة الرمادية المحيطة (الشكل 1F-H).
- قم بتجميع الأنسجة حول البطينين المقطعة في طبق بتري معقم مقاس 10 سم يحتوي على عازلة تشريح الفئران الباردة.
< p class = "jove_title" >
3. عزل واستزراع الحبل الشوكي للفئران البالغة NSPCs
- قم بتنفيذ الخطوات التالية بشكل معقم في غطاء التدفق الرقائقي.
- افرم الأنسجة المحيطة بالبطينين المقطعة إلى قطع 1 مم بمقص دقيق.
- قم بفصل الأنسجة المفرومة إنزيميا مع الإنزيمات المحللة للبروتين باستخدام مجموعة تفكك غراء كما هو موضح في جدول المواد / الكواشف.
ملاحظه: تشتمل مكونات الكاشف على أربع قوارير: قارورة 1: محلول الملح المتوازن من إيرل (EBSS). قارورة 2: غراء يحتوي على L-cysteine و EDTA. قارورة 3: ديوكسيربونوكلياز I (DNase). قارورة 4: مثبط بروتياز البلغم المخاطي مع ألبومين مصل الأبقار (BSA).
ملاحظة: غراء هو بروتياز سلفهيدريل ذو خصوصية واسعة لركائز البروتين. الغراء هنا مشتق من مادة اللاتكس لنبات البابايا كاريكا ويتحلل معظم ركائز البروتين على نطاق أوسع من بروتياز البنكرياس. أثناء عملية التفكك ، هناك بعض تلف الخلايا الذي يتسبب في إطلاق الحمض النووي في وسط التفكك ، مما يزيد من اللزوجة ويجعل سحب العينات صعبا. وبالتالي ، يتم تضمين DNase في إجراء عزل الخلية لهضم الحمض النووي دون الإضرار بالخلايا السليمة. Ovomucoids هي مثبطات بروتين سكري للبروتين البروتين تستخدم لتثبيط نشاط غراء بعد خطوة التفكك.
- عند الاستخدام الأول ، أعد تكوين خليط مثبط البيضات الألبومي (قارورة 4) مع 32 مل من EBSS (قارورة 1) ، ثم قم بتخزينه في 4 درجات مئوية واستخدمه في العزل اللاحق. ملاحظه: ينتج عن هذا محلول بتركيز فعال يبلغ 10 مجم من مثبط الإبويضات و 10 مجم من الألبومين لكل مل.
- أضف 5 مل من EBSS (قارورة 1) إلى قارورة الباغراء (القارورة 2) ، مما ينتج عنه محلول في 20 وحدة من غراء / مل في 1 ملي مولار L-cysteine مع 0.5 ملي EDTA. تأكد من أن محلول غراء يبدو واضحا عند الذوبان تماما. خلاف ذلك ، ضع القارورة في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة عشر دقائق حتى يذوب الغراء تماما لضمان النشاط الكلي للإنزيم.
- أضف 500 ميكرولتر من EBSS (قارورة 1) إلى قارورة DNase (قارورة 3) واخلطها برفق لأن DNase حساس لتمسخ القص. أضف 250 ميكرولتر من محلول DNase إلى قارورة الغراء ، مما ينتج عنه تركيز نهائي يبلغ حوالي 20 وحدة / مل من غراء و 0.005٪ DNase. احفظ الحمض النووي المتبقي لاستخدامه لاحقا.
- ضع أنسجة الفئران المفرومة في محلول غراء.
- احتضان عند 37 درجة مئوية مع تحريض مستمر على منصة هزاز لفصل الأنسجة في محلول غراء المنشط. احتضان أنسجة الفئران لمدة 45 دقيقة إلى 1 ساعة.
- قم بتقطيع الخليط بماصة سعة 10 مل لفصل أي قطع نسيجية متبقية للحصول على معلق خلوي غائم. انقل معلق الخلية (لا تشمل أي قطع من الأنسجة غير المنفصلة) إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 15 مل وجهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في RT.
- أعد تعليق الخلايا المحببة في وسط يحتوي على بويضات ، مثبط غراء.
- تحضير محلول البويضات عن طريق خلط 2.7 مل من EBSS (قارورة 1) مع 300 ميكرولتر من محلول مثبط الألبومين البيضي المعاد تكوينه (قارورة 4) في أنبوب مخروطي سعة 15 مل. أضف 150 ميكرولتر من محلول DNase (قارورة 3).
- تخلص من المادة الطافية من الخلايا المحببة وأعد تعليق حبيبات الخلية على الفور في خليط مثبط الألبومين DNase المخفف.
- افصل الخلايا السليمة عن أغشية الخلايا عن طريق الطرد المركزي من خلال تدرج كثافة متقطع بخطوة واحدة.
- قم بإعداد تدرج الكثافة المتقطع عن طريق إضافة 5 مل من محلول مثبط الألبومين (قارورة 4) إلى أنبوب سعة 15 مل ، وباستخدام ماصة سعة 5 مل ، ضع طبقة برفق وببطء من تعليق الخلية (المحضر كما هو موضح أعلاه) فوق محلول مثبط الألبومين.
- جهاز طرد مركزي عند 70 × جم لمدة 6 دقائق عند RT.
ملاحظه: يجب أن تكون الواجهة بين طبقتي التدرج مرئية بوضوح ، على الرغم من أن الحد الأدنى من الخلط عند هذه الحدود لا يؤثر على النتيجة. تبقى شظايا الغشاء في الواجهة والخلايا المنفصلة في الجزء السفلي من الأنبوب.
- تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من وسط EFH للفئران (دافئ مسبقا عند 37 درجة مئوية). احسب كثافة الخلايا الحية باستخدام مقياس كثافة الدم وقم بوضع الخلايا في قارورة ثقافة T25 بكثافة 10 خلايا / ميكرولتر في EFH. يبلغ العائد النموذجي للخلايا من أنسجة الفئران حوالي 2 × 106 خلايا مع حوالي 80٪ من الجدوى. إذا كانت المزارع النسيلة مطلوبة ، فقم بزراعة الخلايا بكثافة أقل من 10 خلايا / ميكرولتر. احتضان القوارير عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 واسمح للثقافات بالنمو دون إزعاج لمدة أسبوع واحد لتجنب تراكم المجالات.
