$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية للحيوانات المناسبة.
< p class = "jove_title" >
1. إعداد الحلول
- تحضير 500 مل من محلول الغسيل العازلة A (WBA): محلول HEPES 10 ملي في محلول الملح المتوازن من Hank (HBSS). يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
- تحضير 500 مل من محلول الغسيل B (WBB): 0.1٪ ألبومين مصل البقر (BSA) مع محلول HEPES 10 ملي في HBSS. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
- تحضير 300 مل من محلول ديكستران 30٪ في WBA عن طريق خلط المحلول طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. قم بتعقيم المحلول عند 110 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام. بعد التعقيم ، اترك المحلول يرتاح في درجة حرارة الغرفة لمدة 2-3 ساعات. قم بتخزين المحلول في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
- تحضير 100 مل من محلول BSA 0.1٪ في محلول ديكستران بارد. يرج بقوة لمدة 3-4 دقائق ويخزن على حرارة 4 درجات مئوية.
- قم بإعداد وسائط استزراع النسر المعدل (DMEM) الكاملة من Dulbecco عن طريق إذابة مصل العجل بنسبة 20٪ ، 2 ملي من الجلوتامين ، 50 ميكروغرام / مل من الجنتاميسين ، 1٪ فيتامينات ، 2٪ أحماض أمينية النسر القاعدي المتوسط (BME) في وسائط DMEM القاعدية وتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية. أضف 1 نانوغرام / مل من عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF) قبل الاستخدام.
- تحضير وسط الحمض الكامل عن طريق إضافة مكملات نمو الحمض (المزود بوسط الحضواج) و 20٪ مصل عجل الجنين (FCS) في الوسط القاعدي لزراعة الحمضات وتخزينها عند 4 درجات مئوية.
< ص الفئة = "jove_title" >
2. استعادة أنسجة المخ وإزالة السحايا
- من أجل الاتساق ، استخدم الفئران من نفس العمر ونفس الجنس في كل دفعة من الاستخراج. استخدم مأوى للحيوانات خال من مسببات الأمراض ووفر الوصول المخصص إلى المياه. لضمان الكفاءة والحد الأدنى من استخدام ، تجنب فقدان مواد الأنسجة.
- القتل الرحيم C57BL / 6J ، 4-6 أسابيع ، ذكور الفئران (مختبرات Janvier ، Le Genest-Saint-Isle ، فرنسا).
- استئصال أنسجة المخ بسرعة في ظروف معقمة ، وتجنب أي ضرر للأنسجة. ضع الأنسجة بعناية في 40 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات البارد (PBS).
- انقل أنسجة المخ في PBS البارد إلى طبق بتري (100 مم × 15 مم).
- ضع أنسجة المخ على منديل معقم جاف وخالي من النسالة وبملقط منحني ، قم بإزالة الأعصاب المخيخية والمخطط والأعصاب القذالية.
- قم بإزالة جميع السحايا المرئية بقطعة قطن. ضع أنسجة المخ رأسا على عقب وافتح الفصوص بقطعة قطن باستخدام ضربات ضوئية خارجية. قم بإزالة جميع الأوعية الدموية المرئية.
- ضع أنسجة المخ الخالية من السحايا في طبق بتري (100 مم × 15 مم) مع 15 مل من WBB البارد.
< p class = "jove_title" >
3. التجانس
- انقل الأنسجة إلى أنبوب هاون مطحنة الأنسجة Dounce وأضف 3-4 مل من WBB بالملقط.
- افرم المنديل بمدقة "فضفاضة" 55 مرة. اشطف المدقة "السائبة" باستخدام WBB. الآن افرم الملاط بمدقة "ضيقة" 25 مرة.
- قسم الملاط بالتساوي إلى أنبوبين سعة 50 مل وأضف حجم 1.5x من BSA-dextran البارد بنسبة 30٪ ، مع رج الأنابيب بقوة لخلط الملاط.
< p class = "jove_title" >
4. عزل جزء الأوعية الدموية
- بعد هز الأنابيب بقوة ، قم بالطرد المركزي للأنابيب لمدة 25 دقيقة عند 3,000 × جم و 4 درجات مئوية.
- انقل المادة الطافية (جنبا إلى جنب مع طبقة المايلين العلوية) إلى أنبوبين جديدين ، وقم بالطرد المركزي للأنابيب لمدة 25 دقيقة عند 3,000 × جم و 4 درجات مئوية.
- كرر الخطوة 4.2 وحافظ بعناية على الكريات من الطرد المركزي الثاني.
- تخلص من الديكستران والمايلين مع بقايا الأنسجة من الأنابيب من الخطوة 4.3. حافظ على الكريات في WBB البارد.
- قم بتجميع محتويات الأنبوب 1 والأنبوب 2 من الخطوة 4.1 وقم بتكوين الحجم النهائي البالغ 10 مل باستخدام WBB البارد.
- كرر هذه الخطوة للأنابيب من الخطوة 4.2 والخطوة 4.3.
ملاحظة: أخيرا ، هناك 3 أنابيب من 3 أجهزة طرد مركزي.
- افصل الحبيبات باستخدام 6 ضربات لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة سعة 10 مل حتى تختفي كتل مرئية من الكريات.
- قم بتصفية معلقات الخلية لكل أنبوب باستخدام مجموعة مرشح فراغ ومرشح شبكي من النايلون.
ملاحظه: تعد خطوة الترشيح هذه مهمة لإزالة الأوعية الأطول / الأكبر عبر مرشح الشبكة.
- استرجع الشعيرات الدموية وأعد تعليقها عن طريق كشط الفلتر بمساعدة ملقط طرف مسطح أو مكشطة في WBB في درجة حرارة الغرفة. قم بتصفية التعليق بفلتر جديد لاستعادة المزيد من الشعيرات الدموية
- قسم المرشح بالتساوي إلى أنبوبين وجهاز طرد مركزي لمدة 7 دقائق عند 1,000 × جم و RT.
ملاحظة: خلال خطوة الطرد المركزي هذه ، قم بإعداد المحلول الأنزيمي. تحديد حجم WBB المطلوب وفقا لعدد المستخدمة (انظر جدول المواد). أضف 1x من DNase 1 و 1x من Tosyl-L-lysyl-chloromethane hydrochloride (TLCK) (انظر جدول المواد) في WBB وقم بالتسخين المسبق إلى 37 درجة مئوية.
- اجمع الكريات من الخطوة 4.10 في أنبوب واحد باستخدام WBB الدافئ مسبقا مع الإنزيمات. أضف 1x كولاجيناز / منفصل مسخن مسبقا. ضع الأنبوب في حمام ماء المائدة المهتز عند 37 درجة مئوية لمدة 33 دقيقة بالضبط.
- أوقف تفاعل الإنزيم بإضافة 30 مل من WBB البارد. جهاز الطرد المركزي التعليق لمدة 7 دقائق عند 1,000 × جم و RT.
- تخلص من المادة الطافية بعناية وفصل الحبيبات في WBB ب 6 ضربات لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة سعة 10 مل. يجب أن تكون هذه الخطوة أقل صرامة وأسرع نسبيا.
- جهاز الطرد المركزي للتعليق لمدة 7 دقائق عند 1,000 × جم و RT.
ملاحظة: خلال هذه الخطوة ، تخلص من الطلاء من أطباق الاستزراع واشطفها مرة واحدة باستخدام DMEM في درجة حرارة الغرفة. قم بتغطية أطباق زراعة الخلايا لمدة 1 ساعة على الأقل في RT.
- تخلص من المادة الطافية من الأنبوب الذي تم الحصول عليه في الخطوة 4.14 ، وقم بفصل الحبيبات في وسائط DMEM كاملة جديدة ، وقم بلوحة الخلايا (اليوم 0 ، P0) في 9 آبار من ألواح 6 آبار (1 بئر 9.6 سم 2 لكل منها).
< p class = "jove_title" >
5. انتشار الخلايا العمشية الدماغية
- الحفاظ على مزارع الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 في حاضنة معقمة. استبدل وسائط الاستزراع بعد 24 ساعة (اليوم 1) من طلاء الخلايا عن طريق إزالة الحطام بعناية. بعد اليوم 1 ، قم بتغيير وسائط الثقافة كل 48 ساعة.
- راقب زراعة الخلايا لمدة 7-8 أيام على الأقل. بحلول هذا الوقت ، يجب ملاحظة النمو الخلوي في الجزء العلوي من الطبقة الأحادية البطانية.
- قم بتمرير الخلايا في اليوم 8-10 (حسب الالتقاء) في وسط زراعة الحمض إلى المرور 1 (P1) على ألواح الثقافة المطلية بالجيلاتين. قم بتغيير وسائط الثقافة في كل يومين. راقب الخلايا لمدة 6-7 أيام. يتم تقسيم الخلايا على التوالي مرة أخرى إلى الممر 2 (P2) في اليوم 17 [والمقطع 3 (P3) في اليوم 24 فقط إذا لزم الأمر] ، تزرع في وسط محيطي في ألواح مغلفة بالجيلاتين.
ملاحظه: يجب أن تكون الخلايا جاهزة للتجارب / المراقبة عند التقاء 80-90٪ تقريبا.