تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.
< p class = "jove_title" >
1. تحضير مزيج الإنزيم 1 و 2 لكل عينة
ملاحظة: بالنسبة للأحجام التي تزيد عن 2 مل، استخدم ماصة مصلية سعة 10 مل؛ وبالنسبة للأحجام، 200 ميكرولتر-2 مل، استخدم ماصة سعة 1000 ميكرولتر؛ وبالنسبة للأحجام، 21-199 ميكرولتر، استخدم ماصة سعة 200 ميكرولتر؛ وبالنسبة للأحجام، 2-20 ميكرولتر، استخدم ماصة سعة 20 ميكرولتر؛ وبالنسبة للأحجام التي تقل عن 2 ميكرولتر، استخدم ماصة سعة 0-2 ميكرولتر.
- لكل عينة ، قم بإذابة جزء واحد من كل من الإنزيم P والإنزيم A في درجة حرارة الغرفة.
- بالنسبة لمزيج الإنزيم 1 ، اجمع بين 50 ميكرولتر من الإنزيم P و 1900 ميكرولتر من Buffer Z في أنبوب C المسمى (جدول المواد).
- بالنسبة لمزيج الإنزيم 2 ، أضف 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت Y إلى 10 ميكرولتر المذابة من الإنزيم A.
< p class = "jove_title" >
2. بروتوكول تفكك الدماغ للبالغين
ملاحظة: عند العمل مع العينات ، يجب وضع الأنابيب في رف أنبوب في درجة حرارة الغرفة بينما تظل BSA و D-PBS على الجليد ما لم يذكر خلاف ذلك.
- قم بتشغيل المفكك.
- استخدم الملقط لنقل قطع أنسجة الحصين إلى الأنبوب C.
- انقل 30 ميكرولتر من مزيج الإنزيم 2 إلى الأنبوب C. قم بلف الغطاء حتى يشعر بالتوتر ، ثم شده حتى ينقر.
- ضع الأنبوب C رأسا على عقب في موضع المفكك؛ سيتم تعيين الحالة المحددة للعينة (الشكل 1). قم بتأمين السخان فوق الأنبوب C.
- اضغط على أيقونة المجلد ، وحدد مجلد المفضلة ، وقم بالتمرير إلى برنامج 37C_ABDK_02 وحدده. انقر فوق "موافق" لتطبيق البرنامج على جميع أنابيب C المحددة ، ثم اضغط على "ابدأ" (الشكل 1).
- قم بتسمية أنبوب مخروطي واحد سعة 50 مل لكل عينة.
- ضع مصفاة خلية 70 ميكرومتر على كل أنبوب مخروطي سعة 50 مل وبلل ب 2 مل من المخزن المؤقت BSA.
- عند الانتهاء من البرنامج ، قم بإزالة السخان والأنبوب C من الفصل.
- أضف 4 مل من المخزن المؤقت BSA إلى العينة وقم بتطبيق الخليط على مصفاة الخلية على الأنبوب المخروطي سعة 50 مل.
- أضف 10 مل من D-PBS إلى الأنبوب C ، وأغلقه ، وقم بتدوير المحلول برفق. ضعه على مصفاة الخلية على الأنبوب المخروطي سعة 50 مل.
- تخلص من مصفاة الخلية والأنبوب C. جهاز الطرد المركزي للتعليق عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. ثم استنشق وتخلص من المادة الطافية.
< p class = "jove_title" >
3. إزالة الحطام
- أعد تعليق الحبيبات ب 1550 ميكرولتر من D-PBS البارد وانقل التعليق إلى أنبوب مخروطي الشكل 15 مل.
- أضف 450 ميكرولتر من محلول إزالة الحطام البارد والماصة لأعلى ولأسفل (لا تفعل الدوامة).
ملاحظه: محلول إزالة الحطام هو كاشف في مجموعة تفكك براين التجارية للبالغين.
- قم بتراكب 1 مل من D-PBS البارد برفق أعلى تعليق الخلية ، مع الحفاظ على الطرف على جدار الأنبوب المخروطي. كرر حتى يصبح التراكب الكلي 2 مل
ملاحظه: هذه الخطوة حاسمة. أداء بكفاءة ومهارة.
- جهاز طرد مركزي عند 3000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية مع تسارع كامل وفرامل كاملة.
ملاحظه: إذا لم يتم فصل المراحل بوضوح ، كرر الخطوات 7.2-7.3. جهاز الطرد المركزي مرة أخيرة عند 1000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- يجب أن يتكون التعليق الآن من ثلاث طبقات متميزة (الشكل 2). استنشق الطبقة العليا. امسح طرف الماصة ذهابا وإيابا لشفط الطبقة الوسطى البيضاء. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الطبقة الوسطى دون إزعاج الطبقة السفلية.
ملاحظه: هذه الخطوة حاسمة. أداء بكفاءة ومهارة.
- أضف 2 مل من D-PBS البارد والماصة لأعلى ولأسفل للخلط.
- جهاز طرد مركزي عند 1000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية مع تسارع كامل وفرامل كاملة. استنشق وتخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الحبيبات في 1 مل من المخزن المؤقت BSA.
ملاحظة: يمكن إعادة تعليق الخلايا في المخزن المؤقت المناسب ثم تصنيفها مغناطيسيا وعزلها استعدادا لتسلسل الخلية المفردة في هذه المرحلة.
