تحضير معلق أحادي الخلية للخلايا المناعية من أنسجة دماغ الفئران

الملخص

المصدر: DiSano, K.D., et al. عزل أنسجة الجهاز العصبي المركزي والسحايا المرتبطة بها لتحليل المصب للخلايا المناعية. J. Vis. Exp. (2020).

يوضح الفيديو تحضير معلق أحادي الخلية للخلايا المناعية من أنسجة دماغ الفئران. يتضمن الهضم الأنزيمي لإطلاق الخلايا من أنسجة المخ ، يليه الطرد المركزي المتدرج للكثافة لعزل الخلايا المناعية بناء على كثافتها للحصول على تعليق الخلية الواحدة.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.

< p class = "jove_title" >1. تحضير معلقات أحادية الخلية لأنسجة الدماغ والحبل الشوكي

1. انقل أنسجة الدماغ أو الحبل الشوكي باستخدام الوسائط إلى الجزء العلوي من طبق بتري مقاس 100 مم عن طريق صب الأنسجة والوسائط من الأنبوب. باستخدام الملقط ، انقل الأنسجة إلى قاع طبق بتري. افرم الدماغ أو الحبل الشوكي بشفرة حلاقة معقمة. باستخدام شفرة الحلاقة ، انقل الأنسجة المفرومة إلى أسفل اللوحة عن طريق الكشط لجمع الأنسجة.
   ملاحظه: بالنسبة لبروتوكول الهضم الأنزيمي أدناه ، يمكن تجميع ما يصل إلى حبلين نخاعيين معا للمعالجة. يجب معالجة الأدمغة بشكل فردي.
2. باستخدام ماصة مصلية سعة 5 مل ، أضف 3 مل من RPMI (متوسط معهد روزويل بارك التذكاري (مكمل بمصل ربلة الساق الجنينية بنسبة 10٪ (FCS) إلى طبق بتري. باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل ، قم بتمرير الماصة لأعلى ولأسفل لإعادة تعليق الأنسجة في الوسائط ونقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
   ملاحظه: إذا كان التطبيق النهائي عبارة عن تحليل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية أو السائبة أو زراعة الخلايا ، فيجب اختبار مجموعات FCS لضمان عدم تنشيط الخلايا قبل التحليل. بدلا من ذلك ، يمكن معالجة الخلايا باستخدام 1x PBS مع 0.04٪ BSA بدلا من RPMI مع 10٪ FCS.
3. باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل ، اغسل طبق بتري ب 2 مل إضافي من الوسائط لجمع أي أنسجة متبقية ونقلها إلى أنبوب مخروطي الشكل للحصول على حجم إجمالي يبلغ 5 مل. احتفظ بالأنابيب على الجليد بين خطوات المعالجة.
4. باستخدام ماصة، أعد تعليق مسحوق الكولاجيناز I في وسائط Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) للحصول على التركيز المطلوب (أي 100 ملغم/مل). أضف الكولاجيناز من النوع الأول إلى الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على عينة الأنسجة المفرومة للحصول على التركيز النهائي المطلوب (أي 50 ميكرولتر لكل 1 مجم / مل).
   ملاحظه: ستؤدي التركيزات العالية من الكولاجيناز إلى زيادة غلة الخلايا ولكنها يمكن أن تشق علامات سطح الخلية. لذلك ، يجب معايرة الكثير من الكولاجيناز الأول لتحديد التركيز الأمثل المطلوب للحصول على أكبر عدد من الخلايا القابلة للحياة مع جميع علامات سطح الخلية المطلوبة سليمة. على سبيل المثال ، تم اختبار الكولاجيناز الأول بتركيزات نهائية تبلغ 0.5 مجم / مل و 1 مجم / مل و 2 مجم / مل على عينات مفردة من الدماغ أو الحبل الشوكي. تم تحديد صلاحية الخلية باستخدام طريقة استبعاد التريبان الأزرق وتم تقييم علامات سطح الخلية CD45 و CD19 و CD4 عن طريق قياس التدفق الخلوي. أسفر تركيز 1 مجم / مل من الكولاجيناز الأول عن أعلى عدد من الخلايا الحية مع الاحتفاظ بجميع علامات سطح الخلية ذات الأهمية. وبالتالي ، تم استخدام هذا التركيز لمزيد من التجارب لفحص أنواع الخلايا هذه.
5. أعد تعليق مسحوق DNase I برفق باستخدام 0.15 M كلوريد الصوديوم إلى تركيز المخزون المطلوب. أضف DNase I المعلق إلى الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على عينة الأنسجة المفرومة للحصول على تركيز نهائي يبلغ 20 U / mL.
   ملاحظه: تختلف مجموعات DNase I حسب وحدات النشاط لكل مل. سيتغير التركيز المراد إضافته إلى عينة الأنسجة بناء على وحدات نشاط قارورة المخزون لكل مليلتر. التركيز النهائي المطلوب لكل عينة هو 20 وحدة / مل.
6. ضع الأنابيب في رف أنبوبي في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية واحتضنه لمدة 40 دقيقة. اقلب الأنابيب كل 15 دقيقة لخلط الأنسجة جيدا مع الإنزيمات. بعد الحضانة ، أضف 500 ميكرولتر من 0.1 M EDTA (الرقم الهيدروجيني = 7.2) إلى كل أنبوب للحصول على تركيز نهائي قدره 0.01 M EDTA واحتضانه لمدة 5 دقائق إضافية لتعطيل الكولاجيناز.
7. باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل ، أضف 9 مل من RPMI مكملة ب 10٪ FCS إلى كل أنبوب لرفع حجم كل أنبوب إلى ~ 14.5 مل. جهاز طرد مركزي عند 450 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. باستخدام ماصة باستور مع فراغ ، قم بشفط المادة الطافية ، مع الحرص على عدم لمس حبيبات الخلية.
8. باستخدام ماصة مصلية سعة 5 مل ، أضف 3 مل من محلول تدرج كثافة متساوي التوتر بنسبة 100٪ إلى الأنبوب الذي يحتوي على حبيبات الخلية. باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل، أضف وسائط RPMI إضافية بنسبة 10٪ FCS لرفع الحجم النهائي إلى 10 مل وإعادة تعليق حبيبات الخلية لإنشاء طبقة محلول تدرج متساوي التوتر بنسبة 30٪.
   ملاحظه: قم بإعداد وسط تدرج الكثافة متساوي التوتر بنسبة 100٪ مسبقا ، وتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر. لتحضير محلول تدرج كثافة متساوي التوتر بنسبة 100٪ ، قم بتخفيف وسائط تدرج الكثافة (جدول المواد) باستخدام المخزن المؤقت لتخفيف وسائط التدرج الكثافة. قم بإعداد المخزن المؤقت لتخفيف وسائط التدرج الكثافة (80.0 جم / لتر كلوريد الصوديوم ، 3.0 جم / لتر KCl ؛ 0.73 جم / لتر Na₂HPO₄ ، 0.20 جم / لتر KH₂PO₄ ؛ 20.0 جم / لتر جلوكوز) وقم بتعقيم المرشح باستخدام نظام مرشح فراغي. اصنع محلول تدرج كثافة متساوي التوتر بنسبة 100٪ عن طريق خلط جزء واحد من المخزن المؤقت لتخفيف تدرج الكثافة و 9 أجزاء من وسائط تدرج الكثافة. اخلط جيدا.
9. اقلب واخلط كل أنبوب جيدا قبل إضافة الطبقة السفلية لمحلول التدرج المتساوي التوتر بنسبة 70٪. أدخل ماصة مصلية سعة 1 مل تحتوي على 1 مل من محلول تدرج متساوي التوتر بنسبة 70٪ في قاع الأنبوب. ضع ببطء 1 مل من المحلول ، مع الحرص على عدم صنع الفقاعات. قم بإزالة الماصة المصلية ببطء من الأنبوب ، مع الحرص على عدم إزعاج التدرج.
   ملاحظه: بالنسبة للطبقة الأساسية بنسبة 70٪ ، يجب تخفيف محلول التدرج المتساوي التوتر للمخزون بنسبة 100٪ إلى 70٪ باستخدام وسائط RPMI (أي 7 مل من محلول تدرج كثافة متساوي التوتر بنسبة 100٪ و3 مل من وسائط RPMI ممزوجة جيدا). بالإضافة إلى ذلك ، يعد إنشاء طبقة سفلية نظيفة وغير مضطربة بنسبة 70٪ أمرا ضروريا لإزالة حطام المايلين وللحصول على معلقات نقية أحادية الخلية عند واجهة التدرج بعد الطرد المركزي.
10. جهاز طرد مركزي عند 800 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية بدون فرامل. قم بشفط المادة الطافية ، بما في ذلك طبقة حطام المايلين حتى يبقى 2-3 مل في الأنبوب ، مع الحرص على عدم إزعاج طبقة الخلية. احصد طبقة الخلية بين تدرج الكثافة 30/70٪ باستخدام ماصة سعة 1 مل وانقلها إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل.
11. باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل، أضف وسائط RPMI 10٪ FCS لرفع الحجم النهائي إلى 15 مل. جهاز طرد مركزي 450 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية < / > ملاحظه: خلال هذه الخطوة ، يمكن تجميع طبقات الخلايا من أنبوبين إذا لزم الأمر. لا تجمع أكثر من أنبوبين وإلا فلن تتحجب الخلايا بسبب تركيز وسائط التدرج عالي الكثافة.
12. استنشق المادة الطافية بعناية حتى لا تزعج حبيبات الخلية. أعد تعليق الخلايا في حجم / مخزن مؤقت مناسب لحساب الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم (على سبيل المثال ، أعد تعليق حبل شوكي واحد في 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS لتلوين السطح النهائي) (الشكل 1).
13. باستخدام ماصة سعة 1 مل ، انقل معلقات الخلية إلى الجزء العلوي من أنبوب المرشح العلوي (جدول المواد) واسمح للخلايا بالترشيح إلى أسفل الأنبوب لإزالة أي بقايا المايلين المتبقية.
14. باستخدام صبغة استبعاد التريبان الزرقاء ، قم بتخفيفها وعد الخلايا على مقياس كثافة الدم عن طريق حساب متوسط شبكتين على الأقل من 16 مربعا للدقة 40،41.
15. تابع تقنية تحليل الخلية المفردة المطلوبة.
    ملاحظه: باستخدام أشكال مختلفة من الكولاجيناز (على سبيل المثال ، D ، النوع الأول ، النوع الثاني ، النوع الرابع) ، يمكن عزل الخلايا المناعية ، الخلايا الدبقية الصغيرة (الشكل 1) ، الخلايا النجمية ، الخلايا المحيطة ، الخلايا البطانية 49 ، والخلايا العصبية 50 بكفاءة. كانت أعداد الخلايا المنواة التي تم الحصول عليها للنتائج على النحو التالي باستخدام إنزيم الكولاجيناز الأول المعيار: الدماغ الكامل المعالج بالوهم = 500,000-600,000 خلية. دماغ TMEV-IDD كله = 800,000-1,000,000 خلية. الحبل الشوكي الكامل المعالج بالوزيمة = 150,000-200,000 خلية. الحبل الشوكي TMEV-IDD الكامل = 300,000-400,000. سيختلف عدد الخلايا اعتمادا على دقة الجمع والمعالجة وما إذا كان التهاب الجهاز العصبي المركزي موجودا أم لا.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: تحديد الخلايا المناعية المتسللة CD45hi في أنسجة الجهاز العصبي المركزي. (أ) استراتيجية البوابات لتحديد الخلايا المناعية المتسللة CD45hi (P1) ، و CD45lo microglia (P2) ، و CD45- الخلايا الدبقية قليلة التغصن ، والخلايا النجمية ، والخلايا العصبية بين إجمالي الخلايا الحية في الحبل الشوكي من الفئران المعالجة بالزيم (الحمراء) أو TMEV-IDD (الزرقاء). تم اكتشاف الحد الأدنى من خلايا CD45h...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات ألبومين مصل الأبقار ثيرموفيشر العلمي 37002 د الطرد المركزي بيكمان كولتر جهاز الطرد المركزي Allegra X-12R كولاجيناز الأول ورثينجتون LS004196 أنبوب مخروطي الشكل ، 15 مل VWR 525-1069 أنبوب مخروطي الشكل ، 50 مل VWR 89039-658 غطاء زجاجي هاوزر العلمية 5000 جنيه ملقط منحني أدوات العلوم الدقيقة 11003-14 أنبوب البوليسترين القابل للتصرف ، 14 مل فيشر ساينتيك 14-959-1 ب DNase I ورثينجتون LS002139 الثلج الجاف إيرغاز غير متاح دورمونت #7Forceps أدوات العلوم الدقيقة 11271-30 ثنائي هيدرات ملح ثنائي الصوديوم EDTA أمريسكو 0105-500 جرام الإيثانول ، 100٪ أي غير متاح أنبوب الفلتر العلوي ، 5 مل VWR 352235 بقعة قابلة للإصلاح 780 بيكتون ديكنسون 565388 الجلوكوز فيشر للكيماويات د16-500 محلول الملح المغلق من هانك (HBSS) كورنينج 21-020-السيرة الذاتية مقياس الدم أندوين العلمي 02-671-51 ب Hemostat أدوات العلوم الدقيقة 13004-14 هيبس (N-2-هيدروكسي إيثيل بيبيرازين-N-2-حمض السلفونيك الإيثان) ثيرموفيشر العلمي 15630080 كيه سي إل فيشر كيماويات BP366-500 KH2PO4 (اللامائية) سيجما ألدريتش P5655-100G النيتروجين السائل إيرغاز غير متاح كتلة FC للماوس (CD16 / 32) بيكتون ديكنسون 553141 Na2HPO4 (اللامائية) فيشر للكيماويات S374-500 كلوريد الصوديوم فيشر كيماويات إس 671-500 إبرة قياس 25 بيكتون ديكنسون 305122 مصل الفأر العادي ثيرموفيشر العلمي 31881 مصفاة شبكة النايلون VWR هاتف: 352350 اكتوبر ساكورا 4583 بارافورمالدهايد ، 20٪ علوم المجهر الإلكتروني 15713-ث مخفف إلى 4٪ باستخدام 1 × PBS ماصة باستور، 9 بوصات، غير موصولة فيشر ساينتيك 13-678-20 ج برنامج تلفزيون (1x) كورنينج 21-040-السيرة الذاتية PE الجرذ المضاد للفأر CD4 بيكتون ديكنسون هاتف: 553730 PE-CF594 الفئران المضادة للفأر CD19 بيكتون ديكنسون 562329 وسائط التدرج بكثافة Percoll جنرال إلكتريك للرعاية الصحية 17-0891-01 PerCP-Cy5.5 الفئران المضادة للفأر CD45 بيكتون ديكنسون 550994 صحن بتري ، 100 مم VWR 353003 مقياس الأس الهيدروجيني فيشر ساينتيك 13-636-AB150 Pipet-Aid مؤسسة دروموند العلمية 4-000-101 الماصة 200 ميكرولتر جيلسون FA10005M أطراف الماصة، 1 مل الولايات المتحدة الأمريكية العلمية 1111-2831 أطراف الماصة، 200 ميكرولتر الولايات المتحدة الأمريكية العلمية 1111-1816 ماصة، 1 مل جيلسون FA10006M إطالة حامل الماس مع DAPI ثيرموفيشر العلمي ص 36962 منقى الفئران المضادة للفأر CD16 / CD32 بيكتون ديكنسون 553141 أرنب مضاد للفأر CD3 (استنساخ SP7) أبكام أب16669 أرنب مضاد للفأر لامينين أبكام أب11575 الفئران المضادة للفأر ERT-R7 أبكام أب51824 RPMI 1640 كورنينج 10-040-السيرة الذاتية ماصة مصلية ، 1 مل VWR 357521 ماصة مصلية ، 10 مل VWR 357551 ماصة مصلية ، 5 مل VWR 357543 هيدروكسيد الصوديوم فيشر ساينتيك S318-100 سكروز فيشر كيماويات س 5-500 مقص جراحي أدوات العلوم الدقيقة 14001-16 مقص جراحي ، دقيق للغاية روبوز RS-5882 حقنة، 10 مل بيكتون ديكنسون 302995 حقنة 5 مل بيكتون ديكنسون 309646 تريبان بلو جيبكو 15250-061