تقنية لتحسين الثقافة العضوية الدماغية باستخدام إضاءة الضوء اللاتيني الناعم

الملخص

المصدر: Chen، B. et al. ، تسهيل الثقافة العضوية الدماغية عبر إضاءة الضوء الناعم الجانبي.J. Vis. Exp.(2022).

يعرض هذا الفيديو استخدام تقنية إضاءة الضوء اللين الجانبي لتحسين التصور بالعين المجردة للأجسام الجنينية ، وبالتالي تسهيل التلاعب بها ونقلها أثناء زراعة العضوية الدماغية. يوضح إعداد إضاءة الضوء الناعم ، وطرق تغيير الوسائط ونقل الجسم الجنيني ، بالإضافة إلى إجراء إحداث التمايز العصبي في الأجسام الجنينية لتطور العضوية الدماغية.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

< p class = "jove_title" >1. تحضير مصباح الضوء الناعم (اليوم 1)

1. استخدم لوح أكريليك شفاف بسمك 0.3-0.5 سم بحجم ورق A5. لصق وسادات بيضاء على الجزء الأمامي والخلفي من لوحة الأكريليك.
2. قم بتثبيت صف من مصابيح LED البيضاء على حافة اللوحة بحيث يمكن للأضواء الدخول من جانب لوحة الأكريليك ثم إطلاق النار بالتوازي (الشكل 1A-F ، الشكل 2 ب).
   ملاحظه: نظرا لأن أقطار EBs في المرحلة المبكرة تتراوح حوالي 200 ميكرومتر إلى 300 ميكرومتر ، فمن الصعب ملاحظتها بوضوح بالعين المجردة تحت مصباح الفلورسنت للمقاعد النظيفة. في المقابل ، نظرا لتعزيز الانعكاس المنتشر ، يمكننا اكتشاف EBs بوضوح باستخدام الضوء الناعم المضاء جانبيا (الشكل 2 ب ، ج). يوصى باستخدام صفيحة مكونة من 6 آبار لثقافات EB في التجارب اللاحقة. ومع ذلك ، لإظهار التأثير البصري للضوء الناعم بشكل أفضل ، تستخدم الأطباق أحيانا لالتقاط الصور ومقاطع الفيديو في هذه الدراسة بدلا من الأطباق ، لذا من فضلك لا تسيء الفهم. يمكن أيضا استخدام مصباح الضوء الناعم المضاء جانبيا للوحة 6 آبار.

< p class = "jove_title" >2. نقل EB والاستبدال المتوسط (الأيام 2-5)

1. قم بإعداد صفيحة جديدة منخفضة الالتصاق مكونة من 6 آبار وأضف 2 مل من وسط تكوين الجسم الجنيني (EB) إلى كل بئر.
2. قم بإزالة EBs مع الوسط بطرف ماصة عريض التجويف 1000 ميكرولتر (انظر جدول المواد) وانقلها إلى لوحة التصاق المنخفضة المكونة من 6 آبار (~ 100 EBs / بئر).
   ملاحظه: تعتمد عملية التشغيل على مصباح ضوء ناعم (مذكور في الخطوة 1) لتسهيل مراقبة EBs. قم بإيقاف تشغيل مصادر الإضاءة الداخلية الأخرى لتحسين التأثير البصري للضوء الناعم.
3. استبدلها بنفس الحجم من وسط تكوين EB الطازج كل يوم. استخدم التدفق الثانوي لتجميع EBs إلى المركز وتغيير الوسط.
   1. استنشق الوسط القديم عن طريق سحب العينة إلى حافة البئر ببطء. لا تمتص بشدة. خلاف ذلك ، ستتم إزالة EBs معا. ثم أضف وسيطا جديدا لإعادة تعليق EBs.
      ملاحظه: التدفق الثانوي الأساسي (الشكل 2 د). قم بتحفيز تدفق دوامة عن طريق تدوير الطبق على طول مدار دائري. بسبب التدفق الدوامي ، يتم تحفيز تدفق ثانوي وتوجيهه نحو المركز. تتلاقى EBs أو العضيات مع مركز البئر بسبب التدفق الثانوي المتولد من خلال الدوران ، وبعد ذلك يمكن تنفيذ التغيير المتوسط أو نقل الجنين بسهولة.

< ص الفئة = "jove_title" >3. الحث العصبي (الأيام 5-7)

1. قم بإعداد صفيحة جديدة مكونة من 6 آبار ذات التصاق منخفض وأضف 3 مل من وسط الحث العصبي (الجدول 1) إلى كل بئر.
2. قم بتشغيل الضوء الجانبي الناعم (المذكور في الخطوة 1) وقم بإيقاف تشغيل مصادر الإضاءة الداخلية الأخرى.
3. انقل EBs إلى لوحة 6 آبار مع وسيط الحث العصبي المضاف (~ 100 EBs / بئر). أضف أقل قدر ممكن من الوسط الأصلي إلى البئر الجديد.
   ملاحظه: إدخال مهارات بسيطة لنقل العضوية. بطبيعة الحال ، تحت الجاذبية وبكثافة أعلى نسبيا من الوسط ، ستغرق EBs المعلقة تدريجيا من خلال تطبيق العملية الموضحة في الشكل 2E. وبالتالي ، يمكن نقل EBs بسهولة. نظرا لأنه ، بالمقارنة مع EBs ، تغرق الخلايا الحرة وشظايا الخلايا الميتة بشكل أبطأ ، يمكن بالتالي إزالة معظم الخلايا الحرة وشظايا الخلايا الميتة من خلال طريقة الترسيب هذه (الشكل 2F).
4. احتضان العينات عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 24 ساعة
   ملاحظه: تحت المجهر ، كان قطر EBs حوالي 500 ميكرومتر ، وكانت الحافة شفافة ، مما يشير إلى تكوين طبقة ظهارية عصبية.

< p class = "jove_content" > الجدول 1. تكوين وسط الحث العصبي

مكونات حجم DMEM-F12 97 مل مكمل N2 1 مل مكمل جلوتاماكس 1 مل ميم نيا 1 مل الهيبارين التركيز النهائي 1 ميكروغرام / مل

النتائج

الشكل 1: تحضير مصباح الضوء الناعم. (أ) تم تركيب مصدر الطاقة وأضواء LED على جانب واحد من لوح الأكريليك (كما هو موضح في الصندوق المنقط الأحمر). يبلغ الطول الموجي المتناثر لمصباح الضوء الناعم LED 450-470 نانومتر ، والتدفق الضوئي 1300-1800 لومن ، ومؤشر تجسيد اللون هو 75-85 Ra. (ب) تم التحقق مما إذا كانت مصابيح LED يمكن أن تضيء بشكل طبيعي (كما هو موضح في المربع المنقط الأ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مرشح 0.2 ميكرومتر NEST التكنولوجيا الحيوية ، الصين 331001 1000 ميكرولتر طرف ماصة عريض التجويف ثيرمو فيشر العلمي ، الولايات المتحدة الأمريكية 9405163 6 آبار لوحة التصاق منخفضة NEST التكنولوجيا الحيوية ، الصين 703011 يتم استخدامه لثقافات تعليق EBs الطرد المركزي إيبندورف ، ألمانيا 5810 ص يمكن استخدامه للطرد المركزي لأنواع مختلفة من أنابيب الطرد المركزي وزجاجات الكاشف وألواح العمل. DMEM-F12 ثيرمو فيشر العلمي ، الولايات المتحدة الأمريكية 11330032 الهيبارين ميرك ، ألمانيا إتش3149 مكمل جلوتاماكس ثيرمو فيشر العلمي ، الولايات المتحدة الأمريكية 35050061 مكمل جلوتاماكس ثيرمو فيشر العلمي ، الولايات المتحدة الأمريكية 17504044 ميم نيا ثيرمو فيشر العلمي ، الولايات المتحدة الأمريكية 11140050 مكمل N2 ثيرمو فيشر العلمي ، الولايات المتحدة الأمريكية 17502048 مصباح ضوء ناعم بَيْضَة بَيْضَة جهاز بسيط عصامي ، راجع الشكل التكميلي 2 للتحضير.