تحليل إعادة تنشيط الخلايا الجذعية العصبية في مستخلصات ذبابة الفاكهة المزروعة للدماغ

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Naomi Keliinui ، C. ، et al. إعادة تنشيط الخلايا الجذعية العصبية في إختبارات الفاكهة المستنبتة في استخلاصات الدماغ ذبابة الفاكهة المستنبتة. J. Vis. Exp. (2022).

يوضح هذا الفيديو بروتوكولا لتحديد العوامل الخارجية التي تبدأ في إعادة تنشيط ذبابة الفاكهة الخلايا الجذعية العصبية للدماغ من حالتها الهادئة. يتم تشريح اليرقات الحديثة الفقس لعزل أدمغتها ، والتي يتم زراعتها بعد ذلك في وسائط مع أو بدون هرمون اختبار لتقييم قدرة الهرمون على تحفيز إعادة تنشيط الخلايا الجذعية العصبية وتكاثرها.

البروتوكول

1. الثقافة والإعلام وإعداد الأدوات

1. رش المقعد ومنطقة العمل بنسبة 70٪ من الإيثانول واتركه حتى يجف.
2. رش أدوات التشريح والملقط وطبقين زجاجيين للساعات بنسبة 70٪ من الإيثانول واتركها تجف على المقعد.
3. اصنع وسائط شنايدر المكملة (SSM ، الجدول 1) وضعها على الجليد.
4. ماصة 1 مل من SSM في كل طبق من أطباق الساعة الزجاجية.
5. باستخدام ماصة دقيقة ذات طرف معقم ، انقل اليرقات حديثة الفقس من صفيحة PBS إلى SSM في أول طبق ساعة زجاجي. باستخدام ماصة دقيقة ذات طرف معقم ، انقل اليرقات حديثة الفقس إلى SSM في طبق الساعة الزجاجي الثاني.

< p class = "jove_title" >2. التشريح وثقافات الدماغ

1. بمجرد أن تكون اليرقات في طبق الساعة الزجاجي الثاني مع SSM ، قم بتشريح الأدمغة من اليرقات باستخدام ملقط ومجهر تشريح. اضبط التكبير حسب الحاجة.
2. استخدم ملقطا واحدا للاستيلاء على خطافات الفم والآخر ، أمسك الجسم برفق في منتصف الطريق لأسفل واسحب في الاتجاه المعاكس (الشكل 1) لتقسيم اليرقة إلى قطعتين.
   ملاحظه: سيكون الدماغ خلف خطافات الفم مباشرة. لاحظ أنه قد تكون هناك أنسجة أخرى تحيط بالدماغ. كن حذرا جدا عند إزالة هذه الأنسجة لأنها يمكن أن تؤدي إلى إتلاف الدماغ.
بمجرد تشريح
3. 15-20 دماغا ، أضف 1 مل من SSM في بئر واحد من صينية استزراع معقمة مكونة من 12 بئرا. انقل الأدمغة التي تم تشريحها حديثا إلى SSM باستخدام ماصة دقيقة وطرف معقم (الشكل 2 أ).
4. ضع الأدمغة في وسائط SSM في صينية الاستزراع المكونة من 12 بئرا في حاضنة عند 25 درجة مئوية لمدة 24 ساعة (الشكل 2 أ).

< p class = "jove_content" >الجدول 1: وصفة لصنع وسائط شنايدر المكملة (SSM). يسرد الجدول حجم جميع المكونات المطلوبة لتحضير 5 مل من SSM.

المكون (تركيز البدء) لعمل 5 مل التركيز النهائي ذبابة الفاكهة الإعلامية شنايدر 3.89 مل مصل الأبقار الجنينية (100٪) 500 ميكرولتر< 10٪ الجلوتامين (200 مل) 500 ميكرولتر 20 ملم البنسلين (5000 وحدة / مل) ، ستربتومايسين (50،000 ميكروغرام / مل) 100 ميكرولتر 1000 U/مل قلم ، 1 مجم / مل Strep الأنسولين (10 مجم / مل) 10 ميكرولتر 0.02 مجم / مل الجلوتاثيون (50 مجم / مل) 5 ميكرولتر 0.05 مجم / مل في غطاء معقم ، باستخدام تقنية معقمة ، أضف جميع المكونات معا في أنبوب مخروطي سعة 14 مل. ضعه على الثلج حتى الاستخدام.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: ذبابة الفاكهة يرقات في طبق ساعة زجاجي مع SSM. يتم وضع الملقط بشكل صحيح للتشريح. موقع الدماغ اليرقي (الرمادي الداكن) خلف خطافات الفم (أسود) ، وكلاهما يظهر داخل اليرقة.

< p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 2: مزرعة الدماغ والتلوين المناعي. (أ) ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 10 ميكرولتر أطراف ماصة دينفيل العلوم P2102 1000 ميكرولتر أطراف ماصات دينفيل العلوم ص 2103 ن ماصة 1000 ميكرولتر جيلسون ص 1000 24 بئر لوحات ثقافة متعددة الآبار فيشر ساينتيك 50-197-4477 أطباق بتري 35 ملم فيشر ساينتيك 08-757-100 أ مكونات طبق العنب تشريح المجهر زييس ستيمي 2000 مقاومة للإيثانول 200 (100٪) ، ديكون لابرز ، زجاجة 1 جالون فيشر ساينتيك 2701 تستخدم لغسل اليرقات قبل 24 ساعة في وسط الاستزراع مصل الأبقار الجنينية (10٪) سيغما F4135-100 مل مكمل لوسائط زراعة الخلايا. ملقط دقيق للتشريح أدوات العلوم الدقيقة 11295-20 فورسيبت المستخدمة في التشريح. تعمل بشكل أفضل عند شحذها. طبق تشريح الزجاج (3 آبار) لم تعد هذه متوفرة الجلوتاثيون سيغما جي 6013 يوفر حماية مؤكسدة أثناء زراعة الخلايا. حاضنه ثيرمو فيشر العلمي يضمن أن درجة الحرارة والرطوبة والتعرض للضوء متماثلين تماما طوال التجربة. إنسولين سيغما I0516 المتغير المستقل للتجربة غطاء التدفق الصفحي لنقل الوسائط الثقافية ل-جلوتامين سيغما جي 7513 يوفر الدعم أثناء زراعة الخلايا القلم الاسترببوئي سيغما P4458-100 مل تستخدم المضادات الحيوية لمنع التلوث البكتيري للخلايا أثناء الزراعة. عازلة الفوسفات ، درجة الحموضة7.4 صنع في المنزل صنع في المنزل مذيب يستخدم لغسل الأدمغة بعد خطوات التثبيت والتلوين اختار أدوات العلوم الدقيقة 10140-01 تستخدم لقطف اليرقات من صفيحة العنب شنايدر للثقافة المتوسطة لايف تك 21720024 يحتوي على العناصر الغذائية التي تساعد الخلايا على النمو والتكاثر مياه معقمة ماء الأوتوكلاف Milli-Q المصنوع في المنزل مطلوب للحلول