عزل الخلايا قليلة التغصن الأولية في الفئران باستخدام الخرز المناعي المغناطيسي

الملخص

المصدر: Flores-Obando، R.E. et al.، العزل المناعي السريع والمحدد لخلايا الدبقيات قليلة التغصن الأولية للفأر. J. Vis. Exp. (2018).

يوضح هذا الفيديو طريقة لعزل خلايا الخلايا قليلة التغصن الأولية من تعليق الخلايا العصبية التي تم الحصول عليها من جرو الفأر باستخدام الفصل المغناطيسي. تستخدم هذه التقنية حبيبات مغناطيسية مغلفة بأجسام مضادة خاصة بمستضدات الخلايا قليلة التغصن ، مما يتيح العزل الانتقائي لهذه الخلايا.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. تفكك قشرة دماغ الفأر

1. التضحية بجراء الفئران C57Bl / 6N بعد الولادة التي تتراوح أعمارها بين 5 و 7 أيام عن طريق قطع الرأس السريع بمقص تم تنظيفه مسبقا بنسبة 70٪ من الإيثانول.
   ملاحظه: تم استخدام القشرة الدماغية من 5-6 صغار فئران حديثي الولادة لكل مستحضر. في المتوسط ، ينتج دماغ فأر واحد 1-1.5 × 10⁶ خلايا الدبقية قليلة التغصن الأولية (Ols).
2. اقطع جلد فروة الرأس على طول خط الوسط بمقص تشريح صغير واتراجعه لكشف الجمجمة.
3. اقطع الجمجمة بعناية على طول خط الوسط بدءا من الفتحة الموجودة في الجزء الخلفي من الجمجمة باتجاه المنطقة الأمامية ، مع رفع المقص لتجنب إتلاف الدماغ. ثم باستخدام الفتحة الموجودة في الجزء الخلفي من الجمجمة ، قم بقطع كل تجويف للعين على طول قاعدة الجمجمة.
4. استخدم ملقطا دقيقا لإثارة القشرة برفق بعيدا عن الدماغ المتوسط ونقلها إلى طبق زراعة أنسجة مقاس 60 مم يحتوي على 7 مل من B27NBMA. كرر الخطوات من 2.2 إلى 2.4 لكل دماغ ، مع تجميع القشرة التي تم تشريحها.
5. انقل القشرة إلى طبق جديد لزراعة الأنسجة مقاس 60 مم يحتوي على 5 مل من المخزن المؤقت للتفكك (B27NBMA ، 20-30 U / مل Papain ، و 2,500 U DNase I).
6. قم بتقطيع القشرة إلى قطع صغيرة يبلغ طولها حوالي 1 مم³ باستخدام شفرة مشرط # 15 واحتضانها لمدة 20 دقيقة في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون (CO₂).
7. أضف 1 مل من مصل نمو الأبقار (BGS) لإيقاف التفاعل الأنزيمي.
8. انقل القشرة مع وسط التفكك إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل.
9. ابدأ برفق في فصل أنسجة المخ عن طريق سحب العينات ببطء لأعلى ولأسفل 6-8 مرات باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل، مع توخي الحذر لتقليل الفقاعات.
10. اترك قطع الأنسجة تستقر لمدة 2-3 دقائق وانقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد.
11. أضف 3 مل من B27NBMA تحتوي على 10٪ BGS / 2500 U DNase I إلى حبيبات الأنسجة.
12. استخدم ماصة مصلية سعة 5 مل لفصل أنسجة المخ برفق أثناء سحب العينات لأعلى ولأسفل 6-8 مرات. احرص على تقليل الفقاعات.
13. اترك قطع الأنسجة تستقر لمدة 2-3 دقائق.
14. انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد. أضف 3 مل من B27NBMA تحتوي على 10٪ BGS / DNase I إلى حبيبات الأنسجة.
15. قم بفصل أنسجة المخ برفق باستخدام طرف ماصة P1000 ، أثناء سحب مزيج الوسائط وأنسجة المخ لأعلى ولأسفل. كرر الخطوتين 2.13 و 2.14 حتى لا تبقى قطع كبيرة من الأنسجة أو حتى يتم استنفاد B27NBMA تحتوي على 10٪ BGS / DNase I ، أيهما يأتي أولا. احرص على تقليل الفقاعات.
16. تعليق خلية المسبح مع المواد الطفية السابقة.
17. ضع مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب سعة 50 مل. باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل ، مرر معلق الخلية المجمعة برفق فوق مصفاة الخلية التي يبلغ حجمها 70 ميكرومتر.
18. اغسل مصفاة الخلية بإضافة 1 مل من B27NBMA تحتوي على 10٪ BGS / DNase I.
19. تخلص من مصفاة الخلية. ارفع مستوى الصوت إلى 30 مل مع B27NBMA تحتوي على 10٪ BGS / DNase I.
20. انقل معلق الخلية إلى أنبوبين مخروطيين سعة 15 مل. الطرد المركزي تعليق الخلية لمدة 10 دقائق عند 200 × جم.
21. قم بإزالة المادة الطافية دون ترك الخلايا معرضة للهواء. سيكون المادة الطافية غائمة بسبب حطام الخلايا. أضف 3 مل من B27NBMA تحتوي على 10٪ BGS إلى الحبيبات.
22. قم بفصل حبيبات الخلية بعناية باستخدام ماصة P1000. ارفع الحجم إلى 15 مل مع B27NBMA تحتوي على 10٪ BGS.
23. مرر معلق الخلية فوق مصفاة خلية جديدة 40 ميكرومتر.
24. اغسل مصفاة الخلية بإضافة 1 مل من B27NBMA تحتوي على 10٪ BGS. تخلص من مصفاة الخلية.
25. ارفع الحجم إلى 30 مل مع B27NBMA تحتوي على 10٪ BGS.
26. انقل تعليق الخلية إلى 2 × 15 مل أنابيب مخروطية. الطرد المركزي تعليق الخلية لمدة 10 دقائق عند 200 × جم.
27. قم بإزالة معظم المادة الطافية دون ترك الخلايا معرضة للهواء. أعد تعليق كريات الخلية في 5 مل من المخزن المؤقت لفرز الخلايا المغناطيسية المثلجة (MCS).

< p class = "jove_title" >2. تحديد عدد الخلايا وقابليتها للحياة

1. قم بتخفيف 100 ميكرولتر من معلق الخلية ب 400 ميكرولتر من محلول التريبان الأزرق في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل لتحقيق تخفيف بنسبة 1: 5 بنسبة 0.4٪ (وزن / حجم).
2. ضع غطاء زجاجي فوق حجرة مقياس الدم واملأ الغرفتين ب 10 ميكرولتر من تخفيف الخلية باستخدام ماصة P10 وتجنب الإفراط في التعبئة. سوف يمر المحلول تحت زجاج الغطاء عن طريق العمل الشعري.
3. ضع مقياس كثافة الدم على مرحلة المجهر واضبط التركيز باستخدام تكبير 40X.
   ملاحظة: يتم تسجيل عدد الخلايا باستخدام عداد محمول باليد في كل مربع من المربعات الخمسة (أربع زوايا ومركز واحد). فقط الخلايا غير القابلة للحياة تمتص الصبغة وتظهر باللون الأزرق ، بينما تظهر الخلايا الحية والسليمة مستديرة وانكسارة ولا تمتص الصبغة ذات اللون الأزرق ، مما يسمح بتحديد عدد الخلايا القابلة للحياة والكلية لكل مليلتر.

< p class = "jove_title" >3. عزل O4 ⁺ الخلايا قليلة التغصن

1. الطرد المركزي تعليق الخلية عند 200 × جم لمدة 10 دقائق.
2. تخلص من المادة الطافية بعناية باستخدام الشفط بالفراغ ، وتجنب تعرض الخلايا للهواء.
3. أعد تعليق الحبيبات في 90 ميكرولتر من المخزن المؤقت MCS لكل 1 × 10⁷ خلايا إجمالية متبوعة بإضافة 10 ميكرولتر من الخرز المضاد ل O4 لكل 1 × 10⁷ خلايا.
4. امزج معلق الخلية والخرز عن طريق النقر برفق على الأنبوب المخروطي سعة 15 مل بالإصبع 4-5 مرات.
5. احتضن المزيج لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، مع النقر فوق الأنبوب المخروطي سعة 15 مل بإصبعك 4-5 مرات كل 5 دقائق.
6. اغسل المزيج بإضافة 2 مل من المخزن المؤقت MCS برفق لكل 1 × 10⁷ خلايا إلى الأنبوب. جهاز الطرد المركزي المزيج على حرارة 200 × جم لمدة 10 دقائق.
7. تخلص من المادة الطافية باستخدام الشفط بالفراغ بعناية ، وتجنب تعرض الخلايا للهواء. أعد تعليق حبيبات الخلية في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت MCS لكل 1 × 10⁷ خلايا.
8. قم بتوصيل فاصل مغناطيسي بحامل فاصل مغناطيسي. قم بتوصيل عمود تحديد بالفاصل المغناطيسي وضع مصفاة خلية 40 ميكرومتر أعلى العمود. ضع أنبوبين مخروطيين سعة 15 مل أو أنبوب مخروطي واحد سعة 50 مل أسفل عمود الفصل لتجميع التدفق من خلاله.
9. اشطف مصفاة الخلية 40 ميكرومتر وعمود الفصل مسبقا ب 3 مل من المخزن المؤقت MCS واترك المخزن المؤقت يمر عبر العمود دون تركه يجف.
10. أضف مزيج تعليق الخلية والخرز إلى مصفاة الخلية وفي عمود التحديد.
11. اغسل مصفاة الخلية 40 ميكرومتر ب 1 مل من المخزن المؤقت MCS.
12. تخلص من مصفاة الخلية واترك مزيج الخلايا والخرز والمخزن المؤقت يمر عبر العمود دون تركه يجف.
13. اغسل عمود الفصل 3 مرات باستخدام 3 مل من المخزن المؤقت MCS و 1 مرة باستخدام وسائط انتشار OL.
14. قم بإزالة عمود الفصل من الفاصل المغناطيسي ، وضعه بسرعة في أنبوب مخروطي سعة 15 مل ، وأضف على الفور 5 مل من وسائط انتشار OL.
15. ضع مكبسا أعلى العمود وادفعه بقوة لطرد الخلايا المسماة في الأنبوب المخروطي سعة 15 مل.
16. قم بإزالة 100 ميكرولتر من تعليق الخلايا لتحديد عدد الخلايا وقابليتها للبقاء باستخدام Trypan Blue ومقياس كثافة الدم كما هو موضح في القسم 3.
    ملاحظة: تعتبر صلاحية الخلية التي تزيد عن 80٪ مقبولة للمضي قدما في ثقافة OLs ، ولكن الجدوى الأكبر من 90٪ هي الأمثل.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 10 مل ماصات مصلية فيشر ساينتيك 13-676-10 10 مل حقنة طرف Luer-Loc BD ، بيكتون ديكنسون 309604 15 مل أنابيب مخروطية صقر 352097 24 بئر لوحات زراعة الأنسجة صقر 353935 مصفاة خلية 40 ميكرومتر فيشر ساينتيك 22368547 50 مل أنابيب مخروطية الشكل صقر 352098 5 مل ماصات مصلية فيشر ساينتيك 13-676-10 ساعة لوحات زراعة الأنسجة 60 مم صقر 353002 مصفاة خلية 70 ميكرومتر فيشر ساينتيك 22363548 الخرز المضاد ل O4 - المضاد ل O4MicroBeads ميلتيني بيوتيك 130-094-543 مجموعة مرشح الزجاجة الكاملة Autofil ، مرشح 0.22um ، 250 مل الولايات المتحدة الأمريكية العلمية 6032-1101 مجموعة مرشح الزجاجة الكاملة Autofil ، مرشح 0.22um ، 250 مل الولايات المتحدة الأمريكية العلمية 6032-1102 مكمل B27 إنفيتروجين 17504-044 مصل نمو الأبقار (BGS) جنرال إلكتريك للرعاية الصحية لعلوم الحياة SH30541.03 جيش صرب البوسنه فيشر ساينتيك بي بي -1600-100 CNTF بيبروتك 450-50 ديسوكسي ريبونوكلياز I (DNAse I) ورثينجتون LS002007 EDTA فيشر ساينتيك S311 مشارط الريش التي يمكن التخلص منها أندوين العلمي EF7281C الجلوكوز فيشر ساينتيك د16-1 جلوتاماكس إنفيتروجين 35050-61 إنسولين إنفيتروجين هاتف: 12585-014 حامل فاصل مغناطيسي - MACS متعدد الحامل ميلتيني بيوتيك 130-042-303 فاصل مغناطيسي - فاصل MiniMACS ميلتيني بيوتيك 130-042-302 وحدة تصفية Millex PES 0.22 ميكرومتر ميليبور SLG033RS الوسط العصبي أ إنفيتروجين 10888-022 غراء ورثينجتون LS003126 PBS بدون Ca2+ و Mg2+ سيغما د5652 حل مخزون DNase I 1. يذوب في 12،500 U Deoxyribonuclease I / ml في HBSS المبرد على الثلج.
2. تصفية التعقيم على الجليد
3. Aliquot عند 200 ميكرولتر وتجميدها طوال الليل عند -20 درجة مئوية.
4. قم بتخزين الحصص عند -20 إلى -30 درجة مئوية. محلول ملحي ذو فوسفات Dulbecco (بدون Ca2+ و Mg2+) قم بإذابة الكيس في 1 لتر من الماء لإنتاج 1 لتر من الوسط بسعر 9.6 جرام من المسحوق لكل لتر من الوسط. يحفظ في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية. تريبان بلو سوليشن كورنينج 25-900-CI B27NBMA 487.75 مل Neurobasal Medium A ؛ 10 مل B27 الملحق ؛ 1 مل Primocin ؛ 1.25 مل Glutamax ؛ قم بالفلتر والتعقيم وتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. B27NBMA + 10٪ BGS 27 مل B27NBMA 3 مل مصل نمو الأبقار مخزون محلول CNTF (10 ميكروغرام / مل ؛ 1000X) اطلب من Peprotech (450-50). المكياج من 0.1 إلى 1 مجم / مل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (قد تختلف من دفعة إلى أخرى) في المخزن المؤقت (مثل DPBS + 0.2٪ BSA). يحفظ في -80 درجة مئوية
حل العمل (10 ميكروغرام / مل ، 1000X)
1. اصنع 0.2٪ BSA (فيشر العلمي BP-1600-100) في محلول DPBS وتعقيم المرشح.
2. خفف مخزون رئيسي إلى 10 ميكروغرام / مل في معقم ، مبرد 0.2٪ BSA / DPBS.
3. Aliquot (20 ميكرولتر / أنبوب) والتجميد المفاجئ في النيتروجين السائل.
4. تخزين الحصص عند -80 درجة مئوية. المخزن المؤقت لفرز الخلايا المغناطيسية (MCS) تحضير المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) ، ودرجة الحموضة 7.2 ، و 0.5٪ ألبومين مصل الأبقار (BSA) ، 0.5 ملي مولار EDTA ، 5 ميكروغرام / مل أنسولين ، 1 جم / لتر جلوكوز. قم بتعقيم وتفريغ الغازات عن طريق ترشيح المخزن المؤقت عن طريق تمريره عبر مرشح Millex 0.22 ميكرومتر. قم بتخزين المخزن المؤقت على حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام أملاح هانك المتوازنة (HBSS) (سيجما)

1. قم بقياس 900 مل من الماء (درجة الحرارة 15-20 درجة مئوية) في أسطوانة وحركه برفق.
2. أضيفي القوة وقلبي حتى تذوب.
3. شطف العبوة الأصلية مع كمية صغيرة من الماء لإزالة جميع آثار المسحوق.
4. أضف إلى الحل في الخطوة 2.
5. أضف 0.35 غرام من بيكربونات الصوديوم (7.5٪ وزن / حجم) لكل لتر من الحجم النهائي.
6. استمر في التقليب حتى يذوب.
7. اضبط درجة الحموضة في المخزن المؤقت أثناء التقليب إلى 0.1-0.3 وحدة أقل من درجة الحموضة = 7.4 لأنه قد يرتفع أثناء الترشيح. يوصى باستخدام 1N HCl أو 1N هيدروكسيد الصوديوم لضبط الأس الهيدروجيني
8. أضف ماءا إضافيا ليصل الحجم النهائي إلى 1 لتر
9. التعقيم عن طريق الترشيح باستخدام غشاء بمسامية 0.22 ميكرون < / > 10. تخزينها في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية.