تحضير ركيزة منقوشة لدراسة الأنماط الظاهرية لخلية شوان

الملخص

المصدر: Xu ، Z. ، Orkwis ، et al. إعداد البيئات الدقيقة المصفوفة خارج الخلية القابلة للضبط لتقييم مواصفات النمط الظاهري لخلية شوان. J. Vis. Exp. (2020).

يصف الفيديو تحضير ركيزة منقوشة لدراسة مواصفات النمط الظاهري للخلية. يتم استخدام ختم PDMS مطلي بالبروتين لنقل النمط الدقيق على غطاء مطلي ب PDMS. ثم تتم معالجة الغطاء بمادة خافضة للتوتر السطحي لإعاقة التصاق الخلايا على الأسطح غير المرغوب فيها. ثم تضاف الخلايا لتستقر في النمط وتحتضنها لمزيد من التحليل.

البروتوكول

فئة

1. إعداد وتوصيف ركيزة ثقافة الخلايا القابلة للضبط

1. تحضير الركيزة
   1. امزج المطاط الصناعي الأساسي Polydimethylsiloxane (PDMS) وعوامل المعالجة باستخدام طرف ماصة بقوة بنسبة تتراوح بين 10: 1 و 60: 1 حتى تنتشر الفقاعات بشكل متجانس داخل الخليط. قم بإزالة الفقاعات باستخدام التجفيف بالفراغ حتى تتبدد الفقاعات.
      ملاحظة: أثناء بلمرة PDMS ، يرتبط عامل المعالجة ببعضها البعض مع المطاط الصناعي الأساسي لتوفير الخواص الميكانيكية المرغوبة للبوليمر النهائي. يمكن تعديل نسب الارتباط المتقاطع لتغيير صلابة PDMS.
   2. ضع قطرة (~ 0.2 مل) من خليط PDMS المجفف على غطاء مربع أو دائري (على سبيل المثال ، 22 مم × 22 مم) وقم بتدوير الغطاء على مغطي الدوران عند 2500 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية.
   3. احتضن الغطاء إما في فرن على حرارة 60 درجة مئوية لمدة 1-2 ساعة أو في درجة حرارة الغرفة طوال الليل حتى يتجمد نظام إدارة الكثافة الرقمية.
   4. عالج الغطاء باستخدام منظف الأشعة فوق البنفسجية والأوزون لمدة 7 دقائق (الطول الموجي للأشعة فوق البنفسجية: 185 نانومتر و 254 نانومتر) لزيادة ماء السطح. ضعه في طبق معقم من 6 آبار.
   5. قبل استخدامه لزراعة الخلايا ، احتضن الركائز في 70٪ من الإيثانول لمدة 30 دقيقة على الأقل.
      تنبيه: يمكن لمنظف الأوزون بالأشعة فوق البنفسجية أن يولد الأوزون الضار بالبشر. العمل في غطاء دخان كيميائي أو مع شكل من أشكال التهوية.
2. إعداد الركيزة المخططة الدقيقة
   1. ارسم الهندسة المطلوبة ومناطق لصق الخلايا (900 ميكرومتر² و 1,600 ميكرومتر^مربع و 2,500 ميكرومتر²) باستخدام برنامج التصميم بمساعدة الكمبيوتر (CAD). قم بإنشاء قناع ضوئي من الكروم بناء على هذه الأنماط من مورد تجاري.
   2. في غرفة نظيفة أو بيئة خالية من الغبار ، استخدم تقنيات الطباعة الحجرية الضوئية القياسية لتصنيع رقائق السيليكون. المعلمات الحاسمة لهذا التطبيق معين هي كما يلي: مقاوم للضوء: SU-8 2010; ملف تعريف الدوران لتفريق مقاومة الضوء: 500 دورة في الدقيقة لمدة 10 ثوان مع تسارع 100 دورة في الدقيقة / ثانية ، ثم 3500 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية مع تسارع 300 دورة في الدقيقة / ثانية ؛ طاقة التعرض للأشعة فوق البنفسجية: 130 مللي جول / سم 2.< / > ملاحظة: يبلغ ارتفاع الأنماط على رقائق السيليكون حوالي 10 ميكرومتر وفقا لهذه المعلمات. يمكن رؤية الشقوق المحتملة حول الحافة خارج الأنماط المستطيلة أو المثلثة باستخدام مجهر ضوئي بعد الخطوة 1.2.2. يساعد خبز رقاقة السيليكون على حرارة 190 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على إزالة الشقوق.
   3. ضع رقاقة السيليكون المزخرفة داخل طبق بتري دائري بقطر 150 مم × ارتفاع 15 مم وصب PDMS منزوع الغازات (نسبة الخلط 10: 1) كما هو موضح في الخطوة 1.1.1 على رقاقة السيليكون.
      ملاحظة: تأكد من أن سمك PDMS لا يقل عن 5 مم لسهولة التعامل أثناء خطوات طباعة التلامس الصغير.
   4. قم بترسيخ PDMS على رقاقة السيليكون في فرن على حرارة 60 درجة مئوية طوال الليل. اترك PDMS يبرد إلى درجة حرارة الغرفة. قم بقص الطوابع المربعة بدقة مقاس 30 مم × 30 مم والتي تحتوي على الأنماط الصحيحة من رقاقة السيليكون باستخدام مشرط جراحي. لا تتلف رقاقة السيليكون.
      ملاحظة: يمكن إعادة استخدام رقائق السيليكون عدة مرات في هذه المرحلة لإنتاج المزيد من الطوابع بعد التنظيف باستخدام الأيزوبروبانول.
   5. قم بتعقيم طوابع PDMS والأغطية القابلة للضبط (المعدة في الخطوات من 1.1.1 إلى 1.1.3) عن طريق غمرها في 70٪ من الإيثانول لمدة 30 دقيقة.
   6. لتأكيد فعالية النمط الدقيق بواسطة طوابع PDMS بعد طباعة الاتصال المصغر ، قم بتجفيف سطح طوابع PDMS باستخدام تيار هواء مفلتر وماصة 50 ميكروغرام / مل محلول ألبومين مصل بقري (BSA) (Texas Red Contrined) لتغطية الجانب المزخرف بالكامل من ختم PDMS.
   7. احتضان طوابع PDMS بمحلول BSA لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة للسماح بامتصاص البروتين.
   8. جفف سطح الأغطية القابلة للضبط باستخدام تيار هواء مفلتر وقم بزيادة ماء السطح كما هو موضح في الخطوة 1.1.5.
   9. تجفيف طوابع PDMS بالهواء لإزالة محلول BSA المتبقي.
      ملاحظة: احرص على إزالة محلول BSA تماما من الطابع لأن أي محلول متبقي سيؤدي إلى انزلاق الطوابع على الغطاء أثناء طباعة التلامس المصغر.
   10. اجعل الجانب المزخرف من الختم ملامسا مطابقا مع الغطاء القابل للضبط لامتصاص BSA على سطح الغطاء. اضغط برفق على الختم على الغطاء لمدة 5 دقائق
       ملاحظة: لا تقم بتطبيق قوة مفرطة على الختم لأنه سينحني ويسبب اتصالا غير محدد بين الختم والغطاء. يعد المقدار المناسب من القوة المطبقة على الختم ضروريا لطباعة الاتصال الدقيق الناجحة.
   11. افحص النمط المجهري باستخدام مجهر مضان مع مرشح FITC (Fluorescein isothiocyanate).
   12. لطباعة مناطق لاصقة الخلية بدلا من أنماط الفلورسنت ، استبدل اللامينين ببروتين BSA وكرر الخطوات من 1.2.5 إلى 1.2.10.
   13. قم بإزالة الطوابع من أغطية الغطاء وانقل الغطاء إلى صفيحة معقمة من 6 آبار. أضف 2 مل من محلول Pluronic F-127 بنسبة 0.2٪ وزن / فولت في كل بئر لتغطية سطح الغطاء واحتضانه لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
       ملاحظة: يمكن امتصاص Pluronic F-127 على سطح PDMS ، مما يزيد من الكراهية للماء لسطح PDMS لمنع الخلايا من الالتصاق.
   14. استنشق محلول بلورونيك F-127 واغسله 5 مرات بمحلول ملحي عازل للفوسفات (PBS) و 1x بوسط زراعة الخلية قبل بذر الخلايا. كثافة البذر النموذجية ل SCs هي 1,000 خلية / سم².
   15. بعد 45 دقيقة من بذر الخلايا ، قم بإزالة وسط زراعة الخلية وغسل أغطية الغطاء باستخدام PBS 2x لمنع العديد من SCs من الالتصاق بنفس النمط. الحفاظ على الخلايا في بيئة زراعة الخلايا المرغوبة لمدة 48 ساعة قبل القياس الكمي.

المواد