عزل خلايا شوان عن جذور العمود الفقري للفأر

الملخص

المصدر: He ، Q. ، et al. ، & Ding، F. تنقية الخلايا الليفية وخلايا شوان من الأعصاب الحسية والحركية في المختبر. J. Vis. Exp. (2020)

يوضح هذا الفيديو عزل واستزراع خلايا شوان من جذور العمود الفقري للفأر. ثم يتم زراعة الخلايا المعزولة في وسائط معينة. يتم عزل خلايا شوان عن طريق الهضم التفاضلي والالتصاق. يتم نقلها لاحقا إلى أغطية مغلفة بمصفوفة خارج الخلية للربط والانتشار.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. عزل وثقافة الخلايا الليفية العصبية الحركية والحسية و SC (خلايا شوان)

1. استخدم فئران Sprague-Dawley (SD) البالغة من العمر سبعة أيام (n = 4) من مركز التجريبية بجامعة Nantong في الصين. ضع الفئران في خزان يحتوي على 5٪ إيزوفلوران لمدة 2-3 دقائق ، واسمح للحيوانات بالتنفس ببطء وليس لها نشاط مستقل ، ثم قم بتعقيمها باستخدام 75٪ من الإيثانول قبل قطع الرأس.
2. استخدم المقص لقص جلد الظهر لحوالي 3 سم وإزالة العمود الفقري. افتح القناة الفقرية بعناية لكشف الحبل الشوكي.
3. حافظ على الحبل الشوكي في طبق بتري مقاس 60 مم مع 2-3 مل من محلول الملح المتوازن المثلج (HBSS).
4. بناء على البنية التشريحية ، قم باستئصال الجذر البطني (العصب الحركي) ثم الجذر الظهري (العصب الحسي) تحت مجهر تشريح. بعد ذلك ، ضعها في محلول ملح متوازن من D-Hanks (HBSS).
5. بعد إزالة HBSS ، قم بتقطيع الأعصاب إلى قطع 3-5 مم بالمقص وهضمها باستخدام 1 مل من 0.25٪ (وزن / حجم) التربسين عند 37 درجة مئوية لمدة 18-20 دقيقة. بعد ذلك ، استكمل 3-4 مل من DMEM الذي يحتوي على 10٪ مصل بقري جنين (FBS) لوقف الهضم.
6. قم بعرض الخليط لأعلى ولأسفل برفق حوالي عشر مرات وجهاز الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق. بعد ذلك ، تخلص من المادة الطافية الراسب في 2-3 مل من DMEM مع 10٪ FBS.
7. قم بتصفية معلق الخلية باستخدام مرشح شبكي 400 ، ثم قم بتلقيح الخلايا في طبق بتري 60 مم وزراعته عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد 4-5 أيام من الاستزراع ، اعزل الممر 0 (p0) الخلايا الليفية و SCs بعد الوصول إلى 90٪ التقاء.
8. عزل وثقافة SCs (الشكل 1)
   1. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 1x PBS. أضف 1 مل من 0.25٪ (وزن / حجم) من التربسين (37 درجة مئوية) لكل طبق بتري 60 مم لهضم الخلايا لمدة 8-10 ثوان في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، تمت إضافة 3 مل من DMEM مع 10٪ FBS لوقف الهضم.
   2. انفخ الخليط برفق باستخدام ماصة لفصل SCs. بعد ذلك ، اجمع الطرد المركزي SCs عند 800 × جم لمدة 5 دقائق.
   3. تخلص من المادة الطافية البقايا في 3 مل من DMEM مع 10٪ FBS ، و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين ، و 2 ميكرومتر فورسكولين ، و 10 نانوغرام / مل HRG ، ثم قم بتلقيح الخلايا في طبق بتري غير مطلي 60 مم. بعد الزراعة عند 37 درجة مئوية لمدة 30-45 دقيقة ، تلتصق الخلايا الليفية (يتم هضم عدد قليل من الخلايا الليفية باستخدام الخلايا الليفية) بقاع الطبق.
   4. انقل المادة الطافية (بما في ذلك SCs) إلى طبق متوسط آخر مغطى ب poly-L-lysine (PLL) - وثقافت عند 37 درجة مئوية لمدة يومين.

النتائج

الشكل 1: الرسم البياني التخطيطي الذي يوضح خطوات الفصل والتنقية للأرومات الليفية الحسية والحركية و SCs.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات محلول الملح المتوازن من D-Hank جيبكو 14170112 DMEM كورنينج 10-013-السيرة الذاتية تشريح المجهر أوليمبوس SZ2-ILST مصل الأبقار الجنينية (FBS) جيبكو 10099-141 ج فورسكولين سيغما F6886-10 ملغ 0.25٪ (وزن / حجم) التربسين جيبكو هاتف: 25200-072 أطباق الثقافة أنابيب الطرد المركزي أغطية بولي L-يسين حاضنة CO2