$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >1. تحضير ثقافة بطانة الفأر في إدخالات الدعم القابلة للاختراق
ملاحظة: يتم الحفاظ على خلايا BEND3 وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- تحضير وسط خلية BEND3 (BM) عن طريق إضافة 50 مل من FBS و 5 مل من البنسلين والستربتومايسين في 500 مل من DMEM واخلطهم جيدا.
- استنشق الوسط من الطبق واغسل مزرعة خلية BEND3 ب 1 مل من PBS مرة واحدة. أضف 1 مل من 0.25٪ تريبسين EDTA (حمض رباعي الإيثيلين ديامين الرباعي الخليج) إلى الخلايا واحتضانها لمدة 4 دقائق عند 37 درجة مئوية.
- أضف 1 مل من BM إلى الخلايا لتحييد التربسين-EDTA والماصة برفق لأعلى ولأسفل لفصل الخلايا تماما. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل وحبيبات عن طريق الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 5 دقائق عند 400 × جم.
- قم بشفط المادة الطافية من الأنبوب وأعد تعليق الخلايا ب 9 مل من BM الطازج ، ثم أضف 1 مل من تعليق الخلية في ملحق دعم واحد قابل للاختراق. أضف 2 مل أخرى من BM الطازج لكل بئر في الغرفة السفلية للمصفوفة. استمر في زراعة الخلايا ليوم واحد.
< p class = "jove_title" >2. إعداد الثقافة المشتركة العصبية البطانية ونظام وضع العلامات Ac4ManNAz
- في يوم من الأيام ، بعد طلاء خلايا BEND3 في الإدخالات ، قم بشفط الوسط برفق في الغرفة السفلية أولا ، ثم الإدخالات. اغسل وجه الإدخالات 3 مرات باستخدام DMEM الدافئ مسبقا (وسط النسر المعدل من Dulbecco). اغسل السطح الخارجي للحشوات عن طريق الشطف باستخدام DMEM الدافئ مسبقا.
- أضف 1 مل من AM الدافئ مسبقا (وسط ملتصق) في ملحق واحد ، ثم انقل الإدخالات إلى الآبار ذات الخلايا القشرية الأولية. احتضان الاستزراع المشترك عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 12 ساعة.
- قم بإذابة Ac4ManNAz في DMSO (ثنائي ميثيل سلفوكسيد) لتحقيق تركيز مخزون يبلغ 200 مليمتر. بعد 12 ساعة من إعداد الزراعة المشتركة العصبية البطانية ، أضف 1 ميكرولتر من مخزون Ac4ManNAz لكل حجرة سفلية و 0.5 ميكرولتر من المخزون لكل إدراج في الزراعة المشتركة. رج الأطباق على الفور وبرفق لخلط الوسط جيدا. بالنسبة لخلايا التحكم، أضف حجما متساويا من DMSO.
- استزراع الخلايا لمدة 5 أيام أخرى عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2. قم بإعداد AM باستخدام 10x bFGF كوسيط إعادة تغذية (RM). خلال هذا الوقت ، أضف 100 ميكرولتر من RM لكل إدراج و 200 ميكرولتر من RM لكل حجرة سفلية لإعادة تغذية الخلايا البطانية والعصبية كل يومين. أثناء إعادة التغذية ، لا تقم بتزويد Ac4ManNAz أو DMSO في الثقافة.