تحضير الأنابيب البطانية الدماغية من الشرايين المتني للفأر

الملخص

المصدر: Hakim، M. A.، et al.، العزل والتحليل الوظيفي للبطانة البطانية الشريانية لحمة دماغ الفأر. J. Vis. Exp. (2022)

يوضح هذا الفيديو طريقة لعزل الأنابيب البطانية من الحمة الدماغية للفأر. من خلال مزيج من الهضم الأنزيمي والتفكك الميكانيكي ، تنتج العملية أنبوبا سليما به خلايا بطانية.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.

< ص الفئة = "jove_title" >1. المحاليل والأدوية

1. محلول الملح الفسيولوجي (PSS)
   1. قم بإعداد ما لا يقل عن 1 لتر من PSS باستخدام 140 ملي كلوريد الصوديوم ، و 5 ملي كلوريد كلوريد ، و 2 ملي كالسيلون₂ ، و 1 ملي ملي كلوريد_{المغنيد 2} ، و 10 ملي مولار N-2-هيدروكسي إيثيل بيبرازين-N'-2-حمض إيثان سلفونيك (HEPES) ، و 10 ملي مولار جلوكوز.
   2. قم بإعداد المحاليل اللازمة التي تفتقر إلى CaCl₂ (صفر Ca²⁺ PSS) لتشريح الشرايين الدماغية وعزل الأنبوب البطاني.
      ملاحظه: تحضير جميع المحاليل في H2O منزوع الأيونات فائق النقاء ، متبوعا بالترشيح (0.22 ميكرومتر). تأكد من أن المنتج النهائي يحتوي على درجة حموضة 7.4 مع أسمولية بين 290 و 300 مللي أسميال.
2. ألبومين مصل الأبقار (BSA ، 10٪)
   1. قم بإذابة 1 جم من مسحوق BSA المجفف بالتجميد في دورق 10 مل من صفر Ca²⁺ PSS. غطي الدورق واتركيه لمدة ساعتين على الأقل مع التحريك البطيء حتى يذوب BSA.
   2. قم بتصفية المحلول باستخدام حقنة سعة 10 مل بالإضافة إلى مرشح 0.22 ميكرومتر وقم بإعداد 1 مل من الحصص ليتم تخزينها عند -20 درجة مئوية.
3. محلول التشريح
   1. أضف 500 ميكرولتر من BSA (10٪) إلى 49.5 مل من صفر Ca²⁺ PSS لحجم إجمالي قدره 50 مل.
   2. انقل المحلول إلى طبق بتري لتشريح الشرايين.
4. حل التفكك
   1. أضف 5 ميكرولتر من محلول CaCl₂ (1 M) و 500 ميكرولتر من BSA (10٪) إلى 49.5 مل من صفر CaCl²⁺ PSS لحجم إجمالي قدره 50 مل. احتضان المحلول في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة على الأقل.
5. الانزيمات
   1. تحضير 1 مل من محلول الهضم مع 100 ميكروغرام / مل غراء ، 170 ميكروغرام / مل ثنائي إريثريتول ، 250 ميكروغرام / مل كولاجيناز (مزيج من النوع H) ، و 40 ميكروغرام / مل إيلاستاز.
      ملاحظه: يمكن أن تختلف أنشطة الإنزيم ، على الرغم من أن البروتوكولات الناجحة ستتطلب على الأرجح الأنشطة الأنزيمية التالية: ≥ 10 وحدات / مجم لغراء ، ≥ 1 وحدة / مجم للكولاجيناز ، و ≥ 5 وحدات / مجم للإيلاست><از.  

< p class = "jove_title" >2. عزل الشرايين المتني

ملاحظة: يتم اختيار الشرايين الناشئة عن الشرايين الدماغية الوسطى (MCAs) والمضمنة في حمة الدماغ لهذا البروتوكول. يتم عزل الشرايين كما هو موضح سابقا 11 ، مع التعديل.

1. استخدم دبابيس فولاذية (قطر: 0.2 مم ، الطول: 11 إلى 12 مم) لتأمين الدماغ المعزول في محلول تشريح بارد في طبق بتري يحتوي على طلاء بوليمر سيليكون مملوء بالفحم (العمق ≥ 50 سم).
2. باستخدام مقص تشريح حاد ومحاذاة ، قم بقص مستطيل من أنسجة المخ (الطول: 5 مم ، العرض: 3 مم) (الشكل 1 ب) حول MCA مع التأكد من أن الجزء العلوي من جزء الأنسجة قد تجاوز نقطة التفرع من دائرة ويليس. قم بقص مستطيل آخر من أنسجة المخ من نصف الكرة الآخر من الدماغ للوصول إلى المزيد من الشرايين إذا لزم الأمر.
3. قم بتأمين جزء أنسجة المخ المنفصل في الطبق بحيث يكون MCA متجها لأعلى (بعيدا عن دائرة ويليس) باستخدام دبابيس فولاذية (القطر: 0.1 مم ، الطول: 13 إلى 14 مم). قم بعمل شق ضحل بحذر بالقرب من المسامير لإزالة البيا باستخدام ملقط صغير ، وتقشيره برفق من أحد طرفيه باتجاه الطرف الآخر (الشكل 1 ج). قم بإزالة البيا من جزء الأنسجة الآخر للوصول إلى المزيد من الشرايين إذا لزم الأمر. قم بتأمين pia المعزولة بعناية باستخدام الشرايين المتني المتفرعة من MCA في الطبق باستخدام المسامير ، وقم بتشريح الشرايين المتني (الشكل 1D) ، مع التأكد من عدم تلف الشرايين.
   ملاحظه: إذا لم يتم سحب الشرايين بسهولة باستخدام pia من الحمة ، فاستخدم ملقطا دقيقا واحفر في الدماغ ، بدءا من نقطة فرع MCA من دائرة ويليس. حدد موقع الشريان ، وقم بفك الأنسجة المحيطة بالشرايين بعناية (الشكل 1E) ، واسحب الشرايين برفق من الحمة ، مع الاحتفاظ بالطرف العلوي للشريان (الشكل 1F). يمكن عزل الشرايين المتعددة (الطول: ~ 1.5-2 مم) من مستطيل واحد من أنسجة المخ.
4. تأكد من نظافة الشريان بدون أنسجة متصلة به ، وقطع أي فروع بعيدة متبقية (الشكل 2 أ). استخدم هذا الشريان النظيف والسليم للهضم الأنزيمي. بدلا من ذلك ، قم بتقطيع كل شريان إلى قطعتين (الطول: 0.75-1 مم) للهضم الأنزيمي لإعداد الأنابيب البطانية إذا رغبت في ذلك.
    

فئة

3. هضم الشرايين المتني وتحضير الأنابيب البطانية

1. ترتيب المعدات والماصات
   ملاحظه: تم وصف عزل الأنابيب البطانية الشريانية من الدماغ سابقا13،18. يتضمن البروتوكول الحالي تعديلات لعزل البطانة عن الشرايين المتني (داخل الدماغ). يمكن استخدام الشرايين المتعددة و / أو قطع الشرايين معا للهضم الأنزيمي.
   1. قم بتجميع جهاز التخليص 13 لإعداد الأنابيب البطانية باستخدام مرحلة من الألومنيوم تدعم الغرفة وأجهزة المعالجة الدقيقة. قم بتجميع مجهر مجهز بأهداف (5x-60x) وكاميرا متصلة بشاشة الكمبيوتر. قم بتأمين حقنة دقيقة باستخدام وحدة تحكم في المضخة بجوار المسرح والعينة.
   2. قم بتأمين ماصة ثلاثية مملوءة بالزيت المعدني فوق مكبس الحقنة الدقيقة. استخدم المحقنة الدقيقة مع وحدة التحكم في المضخة لسحب محلول التفكك في ماصة التخلي (~130 nL) أعلى الزيت المعدني مع الحرص على تجنب فقاعات الهواء في الماصة.
2. الهضم الجزئي للأجزاء الشريانية
   1. ضع الأجزاء الشريانية السليمة في 1 مل من محلول التفكك في أنبوب زجاجي سعة 10 مل يحتوي على 100 ميكروغرام / مل غراء ، و 170 ميكروغرام / مل ثنائي يثيوإريثريتول ، و 250 ميكروغرام / مل كولاجيناز ، و 40 ميكروغرام / مل إيلاستاز. احتضان الأجزاء الشريانية عند 34 درجة مئوية لمدة 10-12 دقيقة.
   2. بعد الهضم ، استبدل محلول الإنزيم ب 3-4 مل من محلول التفكك الطازج في درجة حرارة الغرفة.
3. عزل الأنبوب البطاني الشرياني < br / > ملاحظة: بعد هضم محلول الإنزيم واستبداله ، قم بنقل جزء واحد أو أكثر من الأجزاء المهضومة جزئيا إلى محلول التفكك في غرفة انصهار فائق متصلة بمنصة متنقلة. أثناء المشاهدة بتكبير 100x إلى 200x ، حدد جزءا واحدا من الوعاء المهضوم جزئيا ولكن غير منقطع وركز عليه تحت المجهر.
   1. ضع ماصة التخلي المتصلة بحاقنة الحقنة الدقيقة في محلول التفكك في الغرفة وضعها بالقرب من أحد طرفي جزء الوعاء المهضوم. اضبط معدلا في نطاق 1-3 نانولتر / ثانية على وحدة التحكم في المضخة للتجربة اللطيفة.
   2. مع الحفاظ على تكبير 100x إلى 200x ، اسحب الجزء الشرياني إلى الماصة ثم أخرجه لفصل adventitia وخلايا العضلات الملساء (الشكل 1B). قم بتقطيع الجزء الوعائي حتى يتم تفكك جميع خلايا العضلات الملساء ، وتبقى الخلايا البطانية فقط على شكل "أنبوب><" سليم. ملاحظه: إذا لزم الأمر أثناء التجربة ، استخدم ملقطا ناعما بعناية لإزالة الملقط المنفصل والصفيحة المرنة الداخلية من الأنبوب البطاني. عادة ما ينتج عن بضع دورات فقط من التخلي عن أنبوب بطاني سليم
   .
   3. استخدم أجهزة المعالجة الدقيقة لتأمين كل طرف من طرفي الأنبوب البطاني على الغطاء الزجاجي في الغرفة باستخدام ماصات تثبيت زجاجية من البورسليكات (الشكل 2C,D).
4. تأمين الأنبوب البطاني الشرياني
   1. استبدل محلول التفكك بمحلول الانصهار الفائق (PSS الذي يحتوي على 2 ملي CaCl₂) مع التأكد من غسل المواد غير البطانية من الغرفة.
   2. انقل الأنبوب البطاني الآمن في المنصة المتنقلة إلى جهاز المجهر المصمم للاندماج المستمر والتسجيلات / التصوير داخل الخلايا أو الفلورسنت.
   3. تطبيق التسليم المستمر ل PSS أثناء التجربة. اضبط معدل التدفق يدويا (5-7 مل / دقيقة) طوال التجربة باستخدام صمام التحكم في التدفق المضمن ، بما يتفق مع التدفق الرقائقي ، مع مطابقة تغذية تدفق المحلول إلى حد الشفط الفراغي. اترك ≥5 دقائق من تدفق PSS إلى الغرفة لنقل الأنبوب البطاني قبل الحصول على بيانات الخلفية و / أو تحميل الصبغة.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: تشريح وعزل الشرايين المتني. (أ) دماغ الفأر المعزول مع دائرة ويليس سليمة. (ب) قطعة مستطيلة تشريح من أنسجة المخ تحتوي على MCA (السهم الأبيض). (ج) عزل البياء عن الجزء العلوي من الأنسجة (الشرايين ، السهم الأزرق). (د) الشرايين (المحددة برؤوس الأسهم الزرقاء) المتصلة بالشرايين الدماغية الوسطى (الأسهم الصفراء). (ه) تم تحديد الشريان (السهم الأزرق) في أنسجة المخ. (و) سحب الشريان (السهم الأز...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مبرد الحمام (Isotemp 500LCU) ثيرموفيشر العلمي 13874647 الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات (التثبيت) وارنر إنسترومنتس جي 150 تي -6 الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات (الأقطاب الكهربائية الحادة) وارنر إنسترومنتس جي سي 100 إف -10 الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات (Trituration) العالمية للأدوات الدقيقة (WPI) ، ساراسوتا ، فلوريدا ، الولايات المتحدة الأمريكية 1ب 100-4 BSA: ألبومين مصل الأبقار سيغما أ 7906 كلوريد_{الكالسيوم 2}: كلوريد الكالسيوم سيغما 223506 كولاجيناز (مزيج من النوع H) سيغما [ك8051] [ك] محول رقمي للحصول على البيانات الأجهزة الجزيئية ، سانيفيل ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية ديجي داتا 1550 أ طبق تشريح (زجاج بتري مع قاع سيلجارد الفحم) أجهزة أنظمة المعيشة ، مدينة سانت ألبانز ، فاتو ، الولايات المتحدة الأمريكية DD-90-S-BLK ديثيوريثريتول سيغما د8255 DMSO: ثنائي ميثيل سلفوكسيد سيغما د8418 الإيلاستاز (البنكرياس الخنزير) سيغما [إ7885] صمام التحكم في التدفق وارنر إنسترومنتس FR-50 واجهة نظام التألق ، مصباح ARC وإمدادات الطاقة ، hyperswitch و PMT الأجهزة الجزيئية ، سانيفيل ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية أنظمة IonOptix ملقط (ناعم الرؤوس ، حاد) FST دومون # 5 & دومون # 55 الجلوكوز سيجما ألدريتش (سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية) جي 7021 هيبس: (4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبيرازين إيثان سلفونيك الحمض) سيغما إتش 4034 KCl: كلوريد البوتاسيوم سيغما ص 9541 MgCl₂: كلوريد المغنيسيوم سيغما M2670 معالج دقيق سيسكيو نظام MX10 مجتذب الماصات الدقيقة (رقمي) أدوات سوتر ، نوفاتو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية ف-97 أو ف-1000 مجهر (مقلوب نيكون ) شركة نيكون إنسترومنتس، ميلفيل، نيويورك، الولايات المتحدة الأمريكية تي إس 2 مجهر (مقلوب نيكون ) شركة نيكون إنسترومنتس اكليبس TS100 مرحلة المجهر (الألومنيوم) سيسكيو ، جرانتس باس ، أوريغون ، الولايات المتحدة الأمريكية 8090 بكسل وحدة تحكم مضخة Microsyringe العالمية للأدوات الدقيقة (WPI) ، ساراسوتا ، فلوريدا ، الولايات المتحدة الأمريكية نظام مايكرو 4 كلوريد الصوديوم: كلوريد الصوديوم سيغما إس 7653 غراء سيغما ص 4762 أهداف تباين الطور شركة نيكون إنسترومنتس (Ph1 DL ؛ 10X و 20X) مقص (شفرات 3 مم و 7 مم) أدوات العلوم الدقيقة (أو FST) ، فوستر سيتي ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية موريا MC52 و 15000-00 مقص (نمط Vannas ؛ شفرات 9.5 مم و 3 مم) أدوات الدقة العالمية 555640 ثانية, 14364 وحدة التحكم في درجة الحرارة (قناة مزدوجة) وارنر إنسترومنتس TC-344B أو C نظام التحكم في الصمام وارنر إنسترومنتس [فك-6]