تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.
< p class = "jove_title" >
1. تشريح القرص الفقري البقري
- اشطف الذيل بالكامل جيدا بماء الصنبور لإزالة الأوساخ والشعر على السطح.
ملاحظه: مع النهايات البعيدة السليمة ، يمكن استخدام 9 أقراص فقرية كحد أقصى (IVDs) (العصعص 1-9) لكل ذيل للتجارب اعتمادا على الحجم المطلوب لأجهزة IVDs. بالنظر إلى القطر المطلوب بين 15-20 مم ، استخدمنا 12 ذيلا من الأبقار مع 5 IVDs لكل ذيل للتجارب.
- اغمر الذيل بالكامل في صندوق يحتوي على محلول بيتادين 1٪ لمدة 10 دقائق. جفف الذيل لفترة وجيزة بشاش معقم وضعه على ستارة معقمة.
ملاحظه: أثناء تشريح القرص ، قم بترطيب ذيول بمحلول Ringer المبلل لمنع الجفاف. قم بتخزين الذيول (أو الأجزاء المتبقية) ملفوفة بشاش مبلل حتى يكتمل إجراء التشريح بالكامل.
- استخدم مشرطا (رقم 20) لإزالة الأنسجة الرخوة بشكل كامل قدر الإمكان من العمود الفقري الذيلي لتسهيل التعرف على IVDs. قم بإزالة العمليات الشائكة والعرضية للفقرات باستخدام كماشة إزالة العظام.
ملاحظه: حدد أجهزة IVD بالقطر المطلوب. تم استخدام أجهزة IVD التي يتراوح قطرها بين 15 و 20 مم في الدراسة الحالية.
- قطع بشكل عرضي باستخدام كماشة عظمية من خلال منتصف كل جسم فقري للحصول على أجزاء حركة فردية. ضع شرائح الحركة في طبق بتري مع شاش مبلل بمحلول رينجر.
- حدد موقع الأنفاب والفقرات عن طريق الجس وتحريك أجزاء الحركة برفق. قم بعمل قطعتين متوازيتين باستخدام المنشار الشريطي في لوحة نمو IVDs ، واحدة على كل جانب من IVD. تحديد موقع صفيحة النمو عن طريق لمس وإيجاد الموقع المحدب لجزء الصفيحة العظمية (الصلبة) المجاور للقرص (الناعم) بمسافة أمان تبلغ حوالي 0.5-1 مم من IVD باتجاه الفقرة. تأكد من تبريد شفرة المنشار الشريطي بمحلول Ringer أثناء قطع
الفقرات.
- انقل IVDs في طبق بتري نظيف بشاش نظيف مبلل بمحلول Ringer.
ملاحظه: يجب ترطيب الشاش وليس رطبا جدا لمنع تورم IVDs ،
- استخدم شفرة المشرط لكشط الجسم الفقري (العظم الأحمر / الوردي) ، صفيحة النمو (الغضروف الأبيض) ، اترك الصفيحة النهائية سليمة (أصفر-وردي). اجعل السطحين مسطحين ومتوازيين لإجراء التحميل. انقل أجهزة IVD المكشطة إلى طبق بتري طازج مع شاش مبلل بمحلول Ringer.
ملاحظه: ارتد قفازا بسلسلة لحماية اليد أثناء إمساك جهاز IVD والكشط.
- قم بقياس ارتفاع القرص وقطره باستخدام الفرجار. نظف الجلطات الدموية في عظم الفقرات بمحلول رينجر باستخدام نظام الغسيل النفاث.
- انقل IVDs إلى أنابيب بلاستيكية سعة 50 مل ، IVD واحد لكل أنبوب. أضف 25 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) + 10٪ بنسلين / ستربتومايسين (P / S) لكل IVD واتركه يهتز لمدة 15 دقيقة على شاكر مداري في درجة حرارة الغرفة.
- استنشق المادة الطافية وأضف 10 مل من PBS + 1٪ P / S لكل IVD لمدة دقيقتين لشطف IVDs.
< p class = "jove_title" >
2. ثقافة IVD وتحميلها
- نقل الأقراص إلى غرف IVD وإضافة وسيط ثقافة IVD (Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM ، 4.5 جم / لتر نسبة عالية من الجلوكوز DMEM للمجموعة الفسيولوجية و 2 جم / لتر منخفض الجلوكوز DMEM للمجموعة المرضية) + 1٪ P / S + 2٪ مصل ربلة الساق الجنينية + 1٪ ITS (يحتوي على 5 ميكروغرام / مل من الأنسولين ، 6 ميكروغرام / مل ترانسفيرين ، و 5 نانوغرام / مل حمض سيلينيوس) + 50 ميكروغرام / مل أسكوربات -2-فوسفات + 1٪ حمض أميني غير أساسي + 50 ميكروغرام / مل عامل مضاد للميكروبات للخلايا الأولية) ويوضع في حاضنة عند 37 درجة مئوية ، 85٪ رطوبة و 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
- زراعة الأقراص لمدة 4 أيام داخل نظام المفاعل الحيوي وفقا للمجموعات التجريبية. في المجموعة المرضية ، حافظ على ظروف التحميل التنكسية عند 0.32-0.5 ميجا باسكال ، 5 هرتز لمدة 2 ساعة / يوم. في مجموعة التحكم الفسيولوجية ، استخدم بروتوكول تحميل من 0.02-0.2 ميجا باسكال ، 0.2 هرتز لمدة 2 ساعة / يوم.
ملاحظه: ضع أجهزة IVD في غرف تحتوي على 5 مل من وسط IVD أثناء إجراءات التحميل. يعتمد الحجم على حجم غرف تحميل المفاعل الحيوي. بين إجراءات التحميل ، ضع أجهزة IVD في ألواح من ستة آبار مع 7 مل من وسط زراعة IVD لاستعادة التورم الحر.
- لتحليل التغيرات في ارتفاع القرص خلال الفترة التجريبية ، قم بقياس ارتفاع القرص باستخدام الفرجار بعد تشريح IVD (خط الأساس) ثم يوميا بعد فترة التورم الحر وبعد التحميل الديناميكي للمدة التجريبية.
