تمايز الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات في الخلايا العصبية باستخدام فيروسات العدسات المهندسة

Abstract

المصدر: Assetta ، B. ، et al. ، جيل الخلايا العصبية البشرية والخلايا قليلة التغصن من الخلايا الجذعية متعددة القدرات لنمذجة تفاعلات الخلايا العصبية قليلة التغصن. J. Vis. Exp. (2020).

يوضح هذا الفيديو عملية تحفيز الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات على التمايز إلى خلايا عصبية عن طريق نقلها بفيروسات عدسية هندسية تحمل جين عامل النسخ العصبي تحت سيطرة عنصر مستجيب للتتراسيكلين ، يليه العلاج بمشتق التتراسيكلين ووسط النضج.

Protocol

< p class = "jove_title" >1. تحريض الخلايا العصبية البشرية من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات

1. تحضير فيروس العدسي (~ 5 أيام ، بروتوكول مفصل كما هو موضح سابقا)
   1. لوحة ~ 1 مليون خلية HEK293T في كل قارورة T75 لجعلها ~ 40٪ ملتصقة عند إجراء التعداد. قم بنقلها بالبلازميدات التي تعبر عن Ngn2 المحفز للتتراسيكلين والجين المقاوم للبورومايسين (PuroR ؛ تحت نفس التحكم في محفز TetO) ، rtTA ، والبلازميدات المساعدة الثلاثة pRSV-REV و pMDLg / pRRE و VSV-G (12 ميكروغرام من الحمض النووي الناقل للفيروسات العدسية و 6 ميكروغرام من كل من الحمض النووي البلازميد المساعد). قم بإعداد ثلاث قوارير على الأقل لكل مستحضر للفيروس. استخدم PEI للتعداء باتباع تعليمات الشركة المصنعة. قم بتغيير الوسائط بعد 16 ساعة وتجاهلها.
   أطلق
   2. الحصاد جزيئات فيروسية عن طريق جمع وسائط الاستزراع كل يوم واستبدالها بوسائط جديدة لمدة 3 أيام. تجمع الوسائط المجمعة التي تحتوي على جزيئات فيروسية للتنقية. قم بتصفية الفيروس من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر وجهاز طرد مركزي عند 49,000 × جم لمدة 90 دقيقة. أعد تعليق الحبيبات بالحجم المناسب من PBS-glucose (~ 150 ميكرولتر).
2. تحريض الخلايا العصبية (~ 5 أيام) < / > ملاحظه: بروتوكول الحث هذا (الشكل 1 أ ؛ مخطط التدفق) فعال للغاية لكل من خلايا iPS و ES من تعدد القدرات التي تم التحقق من صحتها (والتي يمكن فحصها عن طريق تلوين الكيمياء المناعية لعلامات تعدد القدرات المميزة بشكل جيد. الشكل 1 ب).
   1. استخدم خلايا الجذع الجنينية البشرية H1 المتوفرة تجاريا عند مرور 52 (انظر جدول المواد). استزراع الخلايا على ألواح 6 آبار مطلية بمحلول مصفوفة خارج الخلية (~ 0.5 مجم من محلول المصفوفة لكل صفيحة ذات 6 آبار ؛ انظر جدول المواد) باستخدام وسيط صيانة الخلايا ES (انظر جدول المواد) واحتضان الألواح عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
   2. في اليوم -2 ، افصل الخلايا الجنينية الجنينية (80٪ ملتقية) مع 1 مل من محلول انفصال الخلية (انظر جدول المواد) واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. انقل الخلايا إلى أنبوب ؛ اغسل البئر ب 2 مل من الوسائط واجمعها في نفس الأنبوب. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق ، قم بإعادة تعليق الحبيبات في الوسائط ، وقم بوضع الخلايا على ألواح 6 آبار مطلية بالمصفوفة بكثافة بذر 1 × 10₅ خلايا لكل بئر.
   3. في اليوم -1 ، أضف فيروسات العدسات التي تعبر عن Ngn2 بالإضافة إلى PuroR و rtTA مع البوليبرين (8 ميكروغرام / مل) إلى الخلايا الجذعية الجنينية في وسط صيانة الخلايا الجذعية الجنينية الطازجة (انظر جدول المواد). يجب تحديد الكمية الدقيقة للفيروسات من خلال العيارات الفعلية أو المعايرة بالتحليل الكيميائي. نضيف عادة 5 ميكرولتر لكل فيروس لكل بئر في طبق مكون من 6 آبار.
   4. في اليوم 0 ، أضف دوكسيسيكلين (2 ميكروغرام / مل لتنشيط تعبير Ngn2) في وسط DMEM-F12 مع مكمل N2 بدون مورفوجينات.
   5. في اليوم 1 ، أضف Puromycin في وسط طازج من DMEM-F12 بالإضافة إلى N2 و doxycycline ، إلى التركيز النهائي البالغ 1 ميكروغرام / مل متوسط. حدد الخلايا المنقولة في بوروميسين لمدة 24 ساعة على الأقل. قد تكون هناك حاجة إلى تركيز أعلى من بورومايسين (حتى 5 ميكروغرام / مل) وفترة اختيار أطول (تصل إلى 48 ساعة) لإزالة الخلايا غير المنقولة بشكل كاف إذا كان عيار الفيروس منخفضا.
   6. في اليوم 2 ، افصل الخلايا العصبية المتمايزة بمحلول انفصال الخلية (انظر جدول المواد) ، وأعد وضعها على ألواح 24 بئرا (بين 80.000-200.000 خلية / بئر) مطلية بمحلول مصفوفة (انظر جدول المواد) ، واحتفظ بها في وسط NBA / B27 بدون الدوكسيسيكلين. كثافة البذر أمر بالغ الأهمية.
   7. في هذه المرحلة ، يمكن تجميد الخلايا العصبية المنفصلة في وسط تجميد تجاري متخصص (انظر جدول المواد) وتخزينها في النيتروجين السائل لمدة تصل إلى 3 أشهر. يمكن طلاء الخلايا العصبية النقية التي تمثل ~ 15٪ -20٪ موت الخلايا النموذجي بعد الذوبان ، أو زراعتها بمفردها أو مزروعة مشتركة مع أنواع خلايا الدماغ الأخرى.
   8. استزراع iNs النقي على الألواح المطلية بمحاليل قائمة على المصفوفة خارج الخلية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد). يجب أن يكون التشكل الهرمي المميز واضحا بحلول اليوم 4 (واليوم 6 ؛ الشكل 1 ج). يمكن اكتشاف تكوين المشبك في وقت مبكر من اليوم 14 إلى 16 وهو بارز في اليوم 24 عن طريق التلوين الكيميائي المناعي باستخدام علامات قياسية قبل وبعد التشابك. (الشكل 1D ؛ المسمى بعلامة ما قبل التشابك Synapsin 1 وعلامة التغصني Map2).

Results

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: التوليد المباشر للخلايا العصبية التي يسببها الإنسان (iNs) من hPSCs. (أ) مخطط تدفق توليد iN. (ب) تمثيل صور المجال الساطع والتألق المناعي لثقافة البداية للخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (H1) لتأكيد تعدد القدرات. يظهر Oct4 باللون الأحمر و Sox2 باللون الأخضر. (ج) صور ميدانية مشرقة تمثيلية ل iNs في اليومين 4 و6. (د

Materials