Method Article

تفريق الخلايا الجذعية الجنينية للفأر إلى مجموعة من الخلايا العصبية المتصلة بالشبكة

July 8th, 2025

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_content" >المصدر: Hubbard، K. et al.، التقييم الوظيفي للسموم العصبية البيولوجية في الثقافات الشبكية للخلايا العصبية المركزية المشتقة من الخلايا الجذعية.J. Vis. إكسب. (2015).

يوضح هذا الفيديو تقنية لتمايز الخلايا الجذعية الجنينية إلى مجموعة متصلة بالشبكة من الخلايا العصبية ذات نقاط الاشتباك العصبي الوظيفية. يحدد الخطوات المتبعة في تمايز الخلايا الجذعية الجنينية إلى خلايا عصبية ، وتحريض تكوين الشبكة العصبية ، وإثراء الثقافة بالخلايا العصبية الشبكية.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >1. التمايز العصبي

ملاحظة: قم بإجراء الخطوات من 1.1 إلى 1.5 قبل الظهر والخطوة 1.7 بعد الظهر. يتم تقديم نظرة عامة على إجراءات التمايز في الشكل 1 أ.

  1. انقل 350 ميكرولتر (3.5 × 106) من الخلايا الجذعية الجذعية إلى طبق منخفض التعلق مقاس 10 سم يحتوي على وسط تمايز 25 مل. ضعه على شاكر مداري مضبوطة على 30-45 دورة في الدقيقة داخل حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2. هذا هو اليوم الأول من التمايز ، ويسمى اليوم في المختبر (DIV) -8.
    ملاحظه: يؤدي استخدام طبق ملحق منخفض للغاية إلى زيادة تكلفة الطريقة ولكنه ينتج عوائد أكبر قليلا من أطباق بتري البكتيرية لأن الركام يمكن أن يلتصق أحيانا بأطباق بتري. إذا كانت أحجام الأطباق المختلفة مفضلة ، فيمكن قياس الأحجام المتوسطة وأرقام الخلايا وفقا لذلك.
  2. بعد 48 ساعة (DIV -6) ، استخدم ماصة سعة 25 مل لنقل مجاميع الخلايا المتمايزة إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل. أضف على الفور 25 مل من وسط التمايز الطازج إلى طبق بتري.
  3. اترك الركام يستقر أكثر من 2-5 دقائق ، مما ينتج عنه حبيبات مرئية بعمق 1-2 مم. تجاهل الخلايا المفردة أو الركام الصغير المتبقي في حالة تعليق. استنشق الوسط بعناية وانقل حبيبات الخلية مرة أخرى إلى طبق بتري باستخدام P1000. ضعها على شاكر دوار في حاضنة زراعة الأنسجة.
  4. في DIV -4، كرر الخطوة 1.2. سيكون عمق الحبيبات 2-4 مم. استبدل وسط التمايز 30 مل المكمل بحمض الريتينويك المتحول بالكامل (RA) بطبق بتري. ارجع إلى شاكر الدوار في حاضنة زراعة الأنسجة لمدة 48 ساعة إضافية.
  5. في DIV -2، كرر الخطوة 1.3. سيكون عمق الحبيبات 4-8 مم في هذه المرحلة.
  6. في DIV -1 ، قم بإعداد أسطح الطلاء كما في القسم 2.
  7. في DIV 0 ، قم بإذابة 5 مل من وسط التربسين NPC المقتبس مسبقا والمجمد عند 37 درجة مئوية لمدة 5-10 دقائق وضعه في غطاء زراعة الأنسجة. باستخدام ماصة سعة 25 مل ، انقل الركام المفاضل إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل. اسمح للركام بالاستقرار وشفط الوسط بعناية. اغسل الحبيبات مرتين باستخدام 10 مل PBS ، مما يسمح للركام بالاستقرار بين الغسل.
  8. بعد الغسيل الثاني PBS ، أضف 5 مل من وسط التربسين NPC إلى الحبيبات واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  9. أضف 5 مل من مثبط التربسين 0.1٪ من فول الصويا (STI) لتعطيل التربسين واخلطه عن طريق التقليب. قم بترتيورة برفق من 10 إلى 15 مرة باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل حتى يتم إنتاج معلق خلوي متجانس نسبيا.
  10. انقل تعليق الخلية ببطء إلى مصفاة خلية 40 ميكرومتر أو 70 ميكرومتر موضوعة أعلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل. بمجرد تصفية كل المعلق ، أضف 1 مل من وسط N2 لغسل الخلايا المتبقية من خلال الفلتر وحبيبات تعليق الخلية المنفصلة لمدة 6 دقائق عند 200 × جم.
  11. وسط الشفط دون إزعاج الحبيبات. اغسل الخلايا مرتين بوسط N2 سعة 10 مل ، وقم بتكوير الخلايا لمدة 5 دقائق عند 200 × جم وقم بتقطيعها بين الغسلات باستخدام P1000. قبل الغسيل الثاني ، عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم.
  12. أعد تعليق الخلايا في وسط N2 عند 1 × 107 خلايا لكل مل ولوحة ESNs بكثافة خلية تتراوح من 150,000 إلى 200,000 خلية / سم2.
  13. انقل ESNs المطلية حديثا إلى حاضنة زراعة الأنسجة المرطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2 والحفاظ عليها كما في القسم 3.
< p class = "jove_title" >2. تحضير أسطح الثقافة للطلاء السلائف العصبية في DIV 0

  1. قم بإعداد الأطباق المعالجة بزراعة الأنسجة قبل يوم واحد على الأقل من الطلاء. أضف ما يكفي من البولي إيثيلين إيثيلين (PEI ؛ 25 ميكروغرام / مل في H2O المعقم) أو بولي دي ليسين (PDL ؛ 100 ميكروغرام / مل في H2O المعقم) لتغطية الأطباق البلاستيكية المعالجة بزراعة الأنسجة واحتضان O / N عند 37 درجة مئوية.
  2. في صباح يوم الطلاء ، اغسل الأطباق مرتين باستخدام H2O المقطر المزدوج ومرة باستخدام PBS. بعد الغسيل النهائي ، أضف ما يكفي من وسط N2 لتغطية الطبق (على سبيل المثال ، 1 مل لكل بئر من طبق 12 بئر أو 4 مل لكل طبق 6 سم).
  3. قم بإعداد أغطية زجاجية مقاس 18 مم قبل يوم واحد على الأقل من طلاء الخلايا العصبية. نظف الأغطية عن طريق تنظيف البلازما لمدة 4 دقائق.
  4. انقل الغطاء الذي تم تنظيفه على الفور إلى بارافيلم مغسول بالإيثانول في قاع طبق معقم كبير وأضف 400 ميكرولتر من محلول PEI أو PDL ، المحضر كما في الخطوة 2.1. احتضان O / N عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الأنسجة.
  5. في الصباح ، اغسل الغطاء ثلاث مرات بالماء وأضف 5 ميكروغرام / مل من اللامينين في PBS لمدة 1-3 ساعات عند 37 درجة مئوية. قبل تفكيك الخلايا العصبية ، قم بشفط اللامينين وانقل الغطاء على الفور إلى بئر من طبق مكون من 12 بئرا يحتوي على 1 مل من وسط NPC ، مع التأكد من إبقاء الجانب المعالج متجها لأعلى.
  6. قم بتخزين الأطباق والأغطية على حرارة 37 درجة مئوية حتى تصبح الشخصيات غير القابلة للعب جاهزة للطبق.
< ص الفئة = "jove_title" >3. صيانة الخلايا العصبية

  1. في DIV 1 ، قم بالشفط والوسط واستبدله بوسط ثقافة N2.
  2. في DIV 2 و 4 ، قم بالشفط الوسيط واستبدله بوسط استزراع B27.
  3. في DIV 8 ، قم بالشفط الوسيط واستبدله بوسط ثقافة B27 الذي يحتوي على مثبطات الانقسامية للقضاء على الخلايا غير العصبية الملوثة.
  4. في DIV 12، استبدل بوسط الاستزراع B27.
  5. لا تقم بإزالة DIV 12+ ESNs من 5٪ CO2 حتى تصبح جاهزة للاستخدام.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >figure-results-1
الشكل 1. تظل شبكات ESN المتكيفة مع التعليق مستقرة من الناحية الانقسامية وتعبر عن علامات تعدد القدرات.(أ) تخطيطي لصيانة التقييم البيئي والاجتماعي والتمايز. يتميز وجود أو عدم وجود حمض الريتينويك (RA) أو عامل مثبط سرطان الدم (LIF) ب + أو -. يتم توفير مقارنة بين الأيام في المختبر (DIV) ومراحل النمو الكلاسيكية (DS) لثقافات الخلايا العصبية الأولية. (ب) ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Materials

List of materials used in this article Name Company Catalog Number Comments خروج المغلوب DMEM تقنيات الحياة 10829-018 الوسائط: وسط استزراع ESC التركيبة والملاحظات: 500 مل 100x MEM NEAA تقنيات الحياة 11140-050 الوسائط: يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد التركيبة والملاحظات: 6 مل 200 ملي ل-ألانيل-إل-جلوتامين ATCC 30-2115 6 مل مؤهل ES FBS الخلايا الجذعية التطبيقية ASM-5007 90 مل 100x مضادات حيوية سيجما ألدريتش أ 5955 3 مل 55 ملي مولار 2-ميركابتو إيثانول تقنيات الحياة 21985-023 1.1 مل 107 وحدة / مل LIF ميليبور ESG1107 60 ميكرولتر خروج المغلوب DMEM تقنيات الحياة 10829-018 الوسائط: وسيط التمايز ESC الصياغة والملاحظات: 436.6 مل 100x MEM NEAA تقنيات الحياة 11140-050 الوسائط: يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد التركيبة والملاحظات: 5 مل 200 ملي ل-ألانيل-إل-جلوتامين ATCC 30-2115 5 مل مصل مؤهل من ESC الخلايا الجذعية التطبيقية ASM-5007 50 مل 100x مضادات حيوية سيجما ألدريتش أ 5955 2.5 مل 55 ملي مولار 2-ميركابتو إيثانول تقنيات الحياة 21985-023 0.9 مل برنامج تلفزيون Dulbecco سيجما ألدريتش د8537 الوسائط: وسط التربسين NPC التركيبة والملاحظات: 100 مل 0.5 مليون EDTA (18.3٪) سيجما ألدريتش 3690 الوسائط: تجميد في 5 مل aliquot التركيبة والملاحظات: 0.266 مل التربسين سيجما ألدريتش تي 8802 50 ملغ البولي إيثيلين (PEI) سيجما ألدريتش ص 3143 الوسائط: حلول طلاء الأسطح الصياغة والملاحظات: 2.5 ميكروغرام / مل في H20 بولي د-يسين (PDL) سيجما ألدريتش P7280 الوسائط: استخدم في غضون أسبوع واحد التركيبة والملاحظات: 100 ميكروغرام / مل في H20 لامينين سيجما ألدريتش L2020 5 ميكروغرام / مل في H20 DMEM / F12 + جلوتا ماكس تقنيات الحياة هاتف: 10565-018 الوسائط: وسط ثقافة NPC التركيبة والملاحظات: 492.5 مل 100x فيتامينات N2 تقنيات الحياة 17502-048 الوسائط: يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد التركيبة والملاحظات: 5 مل 100x مضادات حيوية سيجما ألدريتش أ 5955 2.5 مل العصبي أ تقنيات الحياة 10888-022 الوسائط: وسيط ثقافة ESN التركيبة والملاحظات: 482.5 مل 50x فيتامين ب 27 تقنيات الحياة 17504-044 الوسائط: يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة شهر واحد التركيبة والملاحظات: 10 مل 200 ملي ل-ألانيل-إل-جلوتامين ATCC 30-2115 5 مل 100x مضادات حيوية سيجما ألدريتش أ 5955 2.5 مل 5-فلورو-2'-ديوكسيوريدين (5FDU) سيجما ألدريتش F0503 الوسائط: 2000x مثبطات الانقسام الحجمي وتخزينها عند -20 درجة مئوية التركيبة والملاحظات: dd 150 ملغ 5FDU و 350 ملغ يوريدين إلى 10 مل Neurobasal A. مرشح معقم ، aliquot وتجميد. استخدم 2000x في وسيط ثقافة ESN. أردين سيجما ألدريتش [أو3003] تريبل إكسبريس تريبسين تقنيات الحياة هاتف: 12605-010 الوسائط: تركيبات متنوعة وملاحظات: تخزينها في RT DMSO سيجما ألدريتش د8418 المتجر في RT مثبط التربسين فول الصويا (STI) سيجما ألدريتش تي 6414 يحفظ في -20 درجة مئوية ايثانول سيجما ألدريتش E7023 المتجر في RT حمض الأسكوربيك سيجما ألدريتش أ 4403 تحضير 100 ملي من المرق عن طريق إذابة 100 مجم من حمض الأسكوربيك في 5.7 مل من مزيج DMSO / الإيثانول 50:50. حمض الريتينويك (RA) سيجما ألدريتش R2625 أعد تعليق 15 مجم RA في 9 مل 50:50 DMSO / الإيثانول. مكمل غذائي يحتوي على 1 مل من مخزون حمض الأسكوربيك 100 مل. Aliquot وتخزينها عند -80 درجة مئوية. منظف البلازما هاريك بلازما PDC-32G أوليمبوس IX51 مجهر مقلوب أوليمبوس غير متاح أغطية زجاجية مقاس 18 مم صياد 12-545-84 مصفاة الخلية (40 ميكرومتر) صياد 08-771-1 ستوفال راقصة شرقية شاكر صياد 15-453-211 أطباق منخفضة الالتصاق صياد 05-539-101 كورنينج 3262 أطباق بكتيرية VWR هاتف: 25384-302 100 × 15 ملم

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Embryonic Stem CellsNeuronal DifferentiationRetinoic Acid TreatmentCell AggregationTrypsin DissociationCell Strainer FiltrationCentrifugation ProtocolNeuronal Network FormationGrowth Factor SupplementationHemocytometer Counting

Related Articles