الفصل المغناطيسي لخلايا شوان عن الأعصاب الوركي للفأر

الملخص

المصدر: Blusch، A.، et al.، في المختبر نخاعي المحاور الطرفية في الزراعة المشتركة للنباتات العقدية الجذرية الظهرية للفئران وخلايا شوان. J. Vis. إكسب. (2023)

يوضح هذا الفيديو طريقة لعزل خلايا شوان عن الألياف العصبية الوركي للفأر.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. زراعة خلايا شوان

1. طلاء لزراعة خلايا شوان
   1. قم بتغطية أطباق زراعة الخلايا في ظروف معقمة. ضع 2 مل من 0.01٪ بولي إل ليسين (PLL) على طبقين لزراعة الأنسجة (TC) مقاس 60 مم لكل منهما واحتضانه طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
   2. قم بإزالة PLL ، واغسل أطباق TC 2x بالماء المقطر ، واحتضن ب 2 مل من 1 ميكروغرام / سم² لامينين طوال الليل عند 4 درجات مئوية. اغسل أطباق TC 2x باستخدام أكوا ديست ، واترك الأطباق تجف في الهواء.
2. تحضير متوسط لزراعة خلايا شوان
   1. تحضير 50 مل من وسط خلية شوان عن طريق إضافة 10٪ مصل ربلة الساق الجنينية المعطلة بالحرارة (FCS), 2 ميكرومتر فورسكولين, 10 نانومتر نيوريجولين, و 50 ميكروغرام/مل جنتاميسين إلى دولبيكو ′ق النسر المعدل المتوسطة (DMEM)/F-12 (ارتفاع الجلوكوز) في ظل ظروف معقمة.
   2. تحضير 70 مل من وسط L-15 من Leibovitz مع 50 ميكروغرام / مل من الجنتاميسين في ظروف معقمة.
3. الهضم الأنزيمي للعصب الوركي
   ملاحظة: يتم تنفيذ الخطوات التالية في ظل ظروف معقمة.
   1. تحضير محلول الهضم الأنزيمي الذي يحتوي على 0.25٪ ديسباز II ، و 0.05٪ من النوع الأول من الكولاجيناز ، و 50 ميكروغرام / مل من الجنتاميسين في 10 مل من DMEM (نسبة عالية من الجلوكوز).
   قم
   2. بالطرد المركزي للأنبوب عند 188 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وقم بإزالة المادة الطافية بماصة مصلية سعة 25 مل ، وانقل الحبيبات مع وسط L-15 المتبقي من Leibovitz إلى طبق زراعة أنسجة 60 مم باستخدام ماصة 1,000 مل.
   3. اشطف الأنبوب سعة 50 مل ب 10 مل من محلول الهضم الأنزيمي وأضفه إلى الطبق الذي يحتوي على الألياف العصبية. وزعي الأنسجة في الطبق بعناية باستخدام طرف الماصة لزيادة السطح الذي يمكن الوصول إليه للهضم.
   4. احتضن عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون لمدة} 18 ساعة ، وأوقف عملية الهضم بإضافة 10 مل من 40٪ FCS في محلول الملح المتوازن من هانكس ، بدون Ca²⁺ و Mg²⁺ (HBSS).
4. فصل الخلايا
   1. انقل الأعصاب المهضومة إلى أنبوب سعة 50 مل باستخدام ماصة مصلية وجهاز طرد مركزي بمعدل 188 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 10 مل من DMEM التي تحتوي على 10٪ FCS و 50 ميكروغرام / مل جنتامايسين. أعد تعليق الحبيبات 20 مرة بعد ذلك ، باستخدام طرف ماصة 10 مل و 5 مل و 2 مل و 1 مل و 200 ميكرولتر.
   2. قم بتصفية معلق الخلية من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر وجهاز طرد مركزي عند 188 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات ب 4 مل من DMEM تحتوي على 10٪ FCS و 50 ميكروغرام / مل جنتامايسين.
   3. أضف 2 مل من تعليق الخلية إلى كل من طبقي TC 60 مم المطليين ب PLL واللامينين ، واحتضانه عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}. اترك الألواح دون أن تمس لمدة يومين في الحاضنة لحماية الخلايا من الإجهاد الميكانيكي ودعم الالتصاق.
5. تمايز خلايا شوان
   1. بعد يومين ، قم بإزالة الوسط واشطف الألواح بعناية 2x باستخدام DMEM (نسبة عالية من الجلوكوز) و 10٪ FCS و 50 ميكروغرام / مل جنتامايسين. بعد ذلك ، أضف 2 مل من وسط خلية شوان. استبدل وسط خلية شوان كل يومين ، وراقب مظهر الخلية والتقائها باستخدام المجهر.
6. التربسين الخلوي والفصل المغناطيسي
   1. عندما تصل الخلايا إلى التقاء حوالي 80٪ (6-12 يوما من الزراعة) ، اغسل الألواح بعناية 2x مع 3 مل من DPBS واحتضانها ب 2 مل من 0.05٪ Trypsin / EDTA (دافئ مسبقا إلى 37 درجة مئوية) لمدة 3 دقائق. عندما تنفصل الخلايا عن قاع اللوحة ، تعطل عملية الهضم عن طريق إضافة 2 مل من DMEM مع 10٪ FCS و 50 ميكروغرام / مل جنتاميسين < br / > ملاحظه: التزم بوقت التربسينية البالغ 3 دقائق بدقة ، واستمر بسرعة بعد ذلك.
   2. أعد تعليق حبيبات الخلية في 2 مل من المخزن المؤقت لفصل الخلايا المغناطيسية المحتوي على DPBS مع 0.5٪ ألبومين مصل بقري (BSA) و 2 نانومتر EDTA. امزج 10 ميكرولتر من تعليق الخلية مع 10 ميكرولتر من التريبان الأزرق وعد الخلايا باستخدام غرفة تلطيخ.
   قم
   3. بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 188 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 90 ميكرولتر من المخزن المؤقت لفصل الخلية المغناطيسية لكل 1 × 10⁷ خلايا. أضف 10 ميكرولتر من ميكروبيدات Thy-1 لكل 1 × 10⁷ خلايا. أعد تعليق المحلول عدة مرات واحتضانه لمدة 15 دقيقة في الظلام عند 8 درجات مئوية.
   4. أضف 2 مل من المخزن المؤقت لفصل الخلية المغناطيسية إلى تعليق الخلية وجهاز الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لفصل الخلايا المغناطيسية.
   5. بلل عمود فصل الخلايا المغناطيسية ب 1 مل من المخزن المؤقت لفصل الخلايا المغناطيسية. ضع عمود فصل الخلية المغناطيسية في فاصل الخلية المغناطيسية. قم بتطبيق الخلايا على عمود فصل الخلايا المغناطيسية. اجمع التدفق من خلال جهاز الطرد المركزي عند 300 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق < / > ملاحظه: يتم اختيار الخلايا الليفية بشكل إيجابي وتبقى في العمود ، بينما تمر خلايا شوان بالعمود. يمكن جمع الخلايا الليفية بختم (على سبيل المثال ، كعنصر تحكم سلبي لبروتوكولات تلطيخ خلايا شوان).
   6. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من وسط الزراعة المشتركة. عد الخلايا بعد تلطيخها باللون الأزرق وغرفة التلوين.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات ألبومين مصل الأبقار كارل روث ، كارلسروه ، ألمانيا 8076.4 مصفاة الخلية ، 100 ميكرومتر BD Bioscience، هايدلبرغ، ألمانيا هاتف: 352360 جهاز طرد مركزي 5810-R Eppendorf AG ، هامبورغ ، ألمانيا 5811000015 حاضنة CO2 Heracell Heraeus Instruments ، هاناو ، ألمانيا 51017865 Dispase II Sigma Aldrich GmbH ، شتاينهايم ، ألمانيا 4942078001 الماء المقطر (نظام تنقية المياه) ميليبور ، مولشيم ، فرنسا ZLXS5010Y DMEM / F-12 ، جلوتاماكس ثيرمو فيشر العلمي ، شويرتي ، ألمانيا 31331093 DPBS (بدون أيونات الكالسيوم ولا أيونات المغنيسيوم) Sigma Aldrich GmbH ، شتاينهايم ، ألمانيا D8537-6X500ML FCS Sigma Aldrich GmbH ، شتاينهايم ، ألمانيا F7524 يجب اختبار FCS لزراعة خلايا Schwann جنتاميسين ثيرمو فيشر العلمي ، شويرتي ، ألمانيا 5710064 HBSS (بدون أيونات الكالسيوم ولا أيونات المغنيسيوم) ثيرمو فيشر العلمي ، شويرتي ، ألمانيا 14170138 لامينين Sigma Aldrich GmbH ، شتاينهايم ، ألمانيا L2020-1MG ماك متعدد المواقف Miltenyi Biotec ، Bergisch Gladbach ، ألمانيا 130042303 مقص دقيق أدوات العلوم الجميلة GmbH ، هايدلبرغ ، ألمانيا 15000-08 مجهر موتيك ، فيتزلار ، ألمانيا موتيك بكالوريوس 400 شريحة مجهر VWR ، رادنور ، الولايات المتحدة الأمريكية 630-1985 فاصل MiniMACS Miltenyi Biotec ، Bergisch Gladbach ، ألمانيا 130091632 أعمدة MS Miltenyi Biotec ، Bergisch Gladbach ، ألمانيا 130-042-201 غرفة عد نيوباور مساعد ، إرلانغن ، ألمانيا 40441 الماصات Eppendorf AG ، هامبورغ ، ألمانيا 2231300004 بولي إل ليسين Sigma Aldrich GmbH ، شتاينهايم ، ألمانيا P4707-50 مل ماصة مصلية ، 10 مل Sarstedt ، Nümbrecht ، ألمانيا 861254025 ماصة مصلية ، 25 مل Sarstedt ، Nümbrecht ، ألمانيا 861685001 ماصة مصلية ، 5 مل Sarstedt ، Nümbrecht ، ألمانيا 861253001 طبق TC 60 ، خلية + Sarstedt ، Nümbrecht ، ألمانيا 833901300 Thy-1 Microbeads (مجموعة MACS) Miltenyi Biotec ، Bergisch Gladbach ، ألمانيا 130-094-523 التربسين EDTA (0.05٪) ، أحمر الفينول ثيرمو فيشر العلمي ، شويرتي ، ألمانيا هاتف: 25300-054 النوع الأول كولاجيناز Sigma Aldrich GmbH ، شتاينهايم ، ألمانيا [ك1639] حمام مائي نوع 1008 GFL ، بورجويدل ، ألمانيا 4285