الحصول على شرائح الدماغ الحصين الفأر الأفقي

الملخص

المصدر: Van Hoeymissen, E., et al. شرائح الحصين الأفقية لدماغ الفأر. J. Vis. Exp. (2020)

يوضح هذا الفيديو بروتوكولا مفصلا لإعداد شرائح دماغ الحصين الأفقية من الفئران ، مع التركيز على الحفاظ على سلامة مسارات ألياف الحصين. تتضمن العملية تقسيم الدماغ وتأمينه بعناية ، واستخدام اهتزاز للتقطيع ، والحفاظ على ظروف الأنسجة المثلى بسائل كربوجين ، مما يؤدي إلى شرائح دماغ الحصين جاهزة لمزيد من التجارب.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية للحيوانات المناسبة.

< p class = "jove_title" >1. تحضير محلول شرائح عالي السكروز والسائل الدماغي النخاعي الاصطناعي (ACSF)

1. قبل اليوم التجريبي
   1. قم بإعداد 1 لتر من محلول مسبق للشريحة 10x مع ماء من النوع 1 من الدرجة المختبرية يحتوي على (بالملليمتر): 25 كيلولوسيلتر ، 20 كلوريد_{السواحل 2} ، 10 ملغ سولتر₄ ، 12.5 كيلو ساعة₂PO₄ (الجدول 1). من أجل منع ترسيب فوسفات الكالسيوم ، قم بخلط المواد الكيميائية ببطء في دورق مملوء مسبقا ب 800 مل H₂O مع التقليب المستمر باستخدام محرك مغناطيسي. قم بتخزين المحلول في درجة حرارة 4 درجات مئوية أو درجة حرارة الغرفة (RT).
2. في اليوم التجريبي
   1. تحضير 1 لتر من 1x ACSF مع ماء من النوع 1 من الدرجة المختبرية يحتوي على (بالملليمتر): 125 كلوريد الصوديوم ، 2.5 كيلولولار ، 2 كلوريد_{المكالسيوم 2} ، 1 ملجمغ 4 ، 1.25 هيدروكليوم_{هيدروكسيد الصوديوم 2}PO₄ ، 26 NaHCO₃ ، 25 جلوكوز (الجدول 2). استخدم مقياس التناضح لضغط البخار للتحقق من صحة الأسمولية بين 305-315 مللي أسم (الرقم الهيدروجيني ~ 7.55-7.6).
      ملاحظه: من أجل منع ترسيب فوسفات الكالسيوم ، قم بخلط جميع المواد الكيميائية الصلبة ببطء في دورق مملوء مسبقا ب 800 مل من H₂O مع التحريك المستمر باستخدام محرك مغناطيسي. أضف MgSO₄ و CaCl₂ في النهاية ، مع تقطير الكمية اللازمة ببطء من محلول مخزون 1 M.
   2. قم بفقاعة 1x محلول ACSF باستمرار في RT مع الكربوجين لضبط الأس الهيدروجيني بين 7.3-7.4.
      ملاحظه: إذا كان الرقم الهيدروجيني مرتفعا جدا أو منخفضا جدا ، فستكون التعديلات الصغيرة في قوة الكربوجين كافية. إذا كان الرقم الهيدروجيني أعلى من 7.45 مع الكربوجين ، فاضبطه عن طريق إضافة بضع قطرات من محلول 1 M NaH₂PO₄.
   3. تحضير 250 مل (لكل دماغ) من محلول شريحة 1x عالي السكروز في دورق يحتوي على 25 مل من محلول مسبق للشريحة 10x و (بالملليمتر): 252 سكروز ، 26 NaHCO₃ ، و 10 جلوكوز (الجدول 3). تحقق من أن الأسمولية تتراوح بين 320-325 مللي أسمول (درجة الحموضة ~ 7.55-7.6).
   4. قم بفقاعة محلول شرائح السكروز عالي السكروز لمدة 10-15 دقيقة باستخدام الكربوجين للتحكم في الرقم الهيدروجيني بين 7.3-7.4.
      ملاحظه: إذا كان الرقم الهيدروجيني أعلى من 7.45 مع الكربوجين ، فاضبطه عن طريق إضافة بضع قطرات من محلول 1 M KH₂PO₄.
   5. قم بتخزين محلول شرائح السكروز عالي السكروز لمدة 20-30 دقيقة في الفريزر الفائق (-80 درجة مئوية) حتى يتجمد جزئيا.

< p class = "jove_title" >2. تشريح وتحديد موضع دماغ الفئران

1. انقل الدماغ إلى طبق المزرعة المبرد مقاس 35 مم وقم بإزالة جميع جزيئات الشعر أو الدم من الأنسجة عن طريق غسل الدماغ برفق باستخدام ماصة باستور مملوءة ب ACSF (الدم له تأثيرات سامة للخلايا على أنسجة المخ).
2. انقل الدماغ بمساعدة الملعقة الموجودة على ورق الترشيح المنقوع أعلى طبق الثقافة المبرد مقاس 90 مم (الشكل 1 أ).
3. استخدم شفرة لقطع الدماغ إلى نصفين ، وفصل نصفي الكرة الأرضية ، ووضع نصفي الكرة الأرضية على الجانب الإنسي المقطوع حديثا.
4. استخدم شفرة لإزالة الجزء الظهري (5٪ -10٪) من الدماغ من كل نصف كرة مع قطع مواز للقمة الظهرية (الشكل 1C) وضع نصفي الكرة الأرضية على الجانب المقطوع حديثا مع توجيه الجزء البطني من الدماغ لأعلى.
5. ضع قطرة من الغراء الفائق على لوحة العينة وافردها بشكل صحيح باستخدام طرف ماصة لاستيعاب نصفي الكرة الأرضية.
6. استخدم حزام ورق الترشيح لالتقاط نصف كرة واحد بقوى شعرية عن طريق لمس الجانب البطني بحزام ورق الترشيح ، وبالتالي عدم إتلاف الأنسجة.
7. استخدم حزاما آخر من ورق الترشيح لتجفيف الجانب الظهري من الدماغ بعناية قبل وضع نصف الكرة الأرضية ، الجانب الظهري لأسفل ، أعلى الغراء على لوحة العينة. كرر نفس الإجراء مع نصف الكرة الثاني.
   ملاحظه: يجب وضع نصفي الكرة الأرضية في محاذاة أفقية بطريقة معكوسة على لوحة الاهتزاز ، مع توجيه الجوانب المنقارية نحو الخارج والجوانب الذيلية تواجه (ولكن لا تلمس) بعضها البعض في المنتصف. يجب أن يشير الجانبان الإنسي لنصفي الكرة الأرضية نحو شفرة الاهتزاز والجوانب الجانبية باتجاه المجرب (الشكل 1 د).
8. ضع صفيحة العينة في غرفة التقطيع وقم بتغطيتها بسرعة ، ولكن بعناية ، بمحلول شريحة سكروز عالي المثلج. بمجرد أن يلمس المحلول الغراء ، سوف يصلب نصفي الكرة الأرضية ويلصقهما بشكل صحيح على لوحة العينة.
9. تأكد من تغطية نصفي الكرة الأرضية بشكل صحيح بمحلول شريحة عالي السكروز وتأكد من أن المحلول مليء بالكربوجين.
   ملاحظه: يجب إجراء إجراء التشريح بالكامل في أسرع وقت ممكن. يرجى التأكد من أن الدماغ لا يبقى بدون إمداد بالأكسجين لفترة طويلة جدا. يجب أن يستغرق الأمر حوالي 1-1.5 دقيقة فقط من قطع الرأس إلى غمر الدماغ في محلول شريحة السكروز عالي السكروز. هذا هو الشرط الأكثر أهمية لمستحضرات شريحة الدماغ الحادة من أجل ضمان جودة عالية للشريحة.

< p class = "jove_title" >3. التقطيع الأفقي للدماغ

1. ضع شفرة الاهتزاز أمام الجانب الإنسي لنصفي الكرة الأرضية وخفضها إلى نفس ارتفاع الجوانب البطنية لنصفي الكرة الأرضية التي تواجه الآن لأعلى. اخفض الشفرة بمساعدة التحكم في الاهتزاز إلى 600 ميكرومتر في الاتجاه الظهري وابدأ في التقطيع. يجب أن تصطدم الشفرة بالأنسجة (إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقم بعكس الشفرة وخفضها أكثر قليلا). قطعيها إلى شرائح حتى يتم فصل الشريحتين الأوليين تماما عن نصفي الكرة الأرضية.
2. اعكس الشفرة وقم بخفض 300 ميكرومتر أخرى وقم بتقطيعها مرة أخرى.
3. عندما يصبح الحصين مرئيا (استخدم أطلس دماغ الفأر للحصول على المساعدة ، إذا لزم الأمر) (الشكل 1E) اجمع الشرائح باستخدام ماصة باستور البلاستيكية الموسعة. اجمع الشرائح حتى يصبح البوتامين المذنب مرئيا بجوار الحصين. عادة ، يمكن جمع ما بين 8-12 شريحة من 300 ميكرومتر (4-6 لكل نصف الكرة الأرضية) لدماغ الفأر.
4. استخدم ماصة باستور البلاستيكية لجمع الشرائح ونقلها إلى غرفة الاسترداد في الحمام المائي (الشكل 1F) (اجمع الشرائح بعد كل جولة من التقطيع لمنعها من الطفو في حجرة الشريحة).
   ملاحظه: اعمل بأسرع ما يمكن وتأكد من أن محلول شرائح السكروز عالي السكروز بارد مثلج ومكربوجين أثناء الإجراء بأكمله. إذا لزم الأمر ، أعد ملء الثلج المحيط بغرفة الشريحة.

< p class = "jove_title" >4. استعادة شرائح الدماغ للتسجيلات الفيزيولوجية الكهربية

1. اترك الشرائح في غرفة الاسترداد المملوءة ب ACSF في الحمام المائي 32 درجة مئوية لمدة 1 ساعة < / > ملاحظة: غرف الاسترداد متاحة تجاريا أيضا.
2. أخرج غرفة الاسترداد من الحمام المائي.
3. ضع الشرائح في RT لمدة 30 دقيقة أخرى على الأقل للتعافي قبل البدء في أي تطبيق آخر.

وصفات المخزن المؤقت والوسائط.

< p class = "jove_content" >الجدول 1: 10 × محلول مسبق للشريحة (1 لتر).

مركب التركيز (مللي متر) الوزن الجزيئي (جم / مول) المبلغ (جم) كيه سي إل 25 74.55 دولار 1.86 كلوريد_{الهواء 2} * 2 ساعة₂س 20 147.01 دولار 2.94 دولار أمريكي MgSO₄ * 7 ساعات₂O 10 246.48 دولار 2.46 KH₂PO₄ 12.5 136.08 دولار 1.7 < p class = "jove_content" >الجدول 2: 1x ACSF (1 لتر) (الأسمولية بين 305-315 مللي أسم).

مركب التركيز (مللي متر) الوزن الجزيئي (جم / مول) المبلغ (جم) كلوريد الصوديوم 125 ريال 58.44 دولار 7.3 كيه سي إل 2.5 74.55 دولار 0.19 كلوريد_{الهواء 2} * 2 ساعة₂س 2 من محلول 1 M CaCl₂ 2 مل MgSO₄ * 7 ساعات₂O 1 من محلول 1 م MgSO₄ 1 مل NaH₂PO₄ * 2H₂O 1.25 156.02 دولار 0.2 NaHCO₃ 26 84.01 دولار 2.18 [إ] الجلوكوز * H₂O 25 198.17 دولار 4.95 دولار < p class = "jove_content" > الجدول 3: 1x محلول شريحة عالي السكروز (250 مل) (الأسمولية بين 320-325 مللي أسم).

مركب التركيز (مللي متر) الوزن الجزيئي (جم / مول) المبلغ (جم) دقة شريحة 10x غير متاح غير متاح 25 مل سكروز 252 ريال 342.3 [إ] 21.57 دولار NaHCO₃ 26 84.01 دولار 0.55 الجلوكوز * H₂O 10 198.17 دولار 0.49

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: معلومات مفصلة عن إعداد شرائح دماغ الحصين الأفقية. (أ) صورة للأدوات اللازمة لتشريح وتقطيع دماغ القوارض: (أ) أحزمة من ورق الترشيح بطول ±2 سم وعرض ±0.5 سم (مثل الدرجة 413)؛ (ب) الشفرة؛ (ج) الغراء الفائق؛ (د) طرف الماصة؛ (ه) لوحة العينة (تأتي مع اهتزاز) ؛ (و) طبق استزراع 35 مم؛ (ز) فرشاة ناعمة؛ (ح) ملعقة؛ (ط) ملقط منحني؛ (ي) مقص التشريح؛ (ك) مقص قوي (طول الشفرة يزيد عن 10 سم) ؛ (ل) ما...

المواد