توليد شرائح اللوزة المائلة من دماغ الفأر

الملخص

المصدر: Bosch, D., et al. Ex vivo التشريح البصري الوراثي لدوائر الخوف في شرائح الدماغ. J. Vis. Exp. (2016)

يوضح الفيديو توليد شرائح اللوزة الدماغية المائلة من دماغ الفأر. يتم وضع الدماغ بزاوية على مرحلة عينة الاهتزاز للحصول على شرائح تحتوي على اللوزة والمحاور من قشرة الفص الجبهي الإنسي التي تشكل روابط متشابكة مع اللوزة. يتم الحفاظ على شرائح الدماغ في درجة الحرارة الفسيولوجية للحفاظ على الأنسجة لمزيد من التجارب.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

< ص الفئة = "jove_title" >1. تحضير الشرائح الحادة

1. تحضير السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي (ACSF) ، ومحلول القطع ، والأدوات (المقص ، والمشرط ، والملقط ، والملعقة ، وماصة باستور) ، وكتل أجار.
   ملاحظة: مطلوب 1 لتر من السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي (ACSF) لكل تجربة ، ويتم تحضيره عن طريق إذابة المواد الكيميائية في H₂O المقطر المزدوج كما تم نشره سابقا. يتم تحضير محلول القطع عن طريق استكمال 200 مل من ACSF مع 0.87 مل من محلول مخزون 2 M MgSO₄.
2. أكسجين ACSF ومحلول القطع طوال التجربة مع 95٪ O₂ و 5٪ CO_2.
3. تخدير الفأر بعمق باستخدام جهاز تخدير حيواني صغير باستخدام الأيزوفلوران (3٪ في الأكسجين). تحقق من عمق التخدير باستخدام منعكس انسحاب الأطراف قبل المتابعة.
4. اقطع رأس الماوس باستخدام مقص كبير وقم بتبريد رأسه على الفور في محلول القطع المثلج.
5. افتح الجمجمة بشق واحد في خط الوسط من الذيلية إلى المنقارية وادفع قطع الجمجمة برفق إلى الجانبين باستخدام الملقط. قم بإزالة الدماغ بسرعة عن طريق رفعه برفق من الجمجمة باستخدام ملعقة صغيرة مستديرة. قطع المخيخ بمشرط. ضع الدماغ في محلول القطع المثلج.
6. بالنسبة لقشرة الفص الجبهي الإنسي أو مواقع حقن mPFC: قم بقطع الجزء الأمامي من الدماغ (الذي يحتوي على mPFC) باستخدام مشرط ووضعه في محلول القطع المثلج حتى التقطيع
.
7. قم بإزالة محلول القطع الزائد بورق الترشيح وألصق الجزء الخلفي من الدماغ على مرحلة الاهتزاز.
8. بالنسبة لشرائح اللوزة المائلة ، قم بلصق الدماغ على كتلة أجار (4٪) مقطوعة بزاوية 35 درجة (الشكل 1D ، الوسط). بالنسبة لشرائح اللوزة الإكليلية ، مواقع حقن النواة الركبية الإنسية / نواة المهاد الخلفية داخل الصفيحة (MGm / PIN) ومواقع حقن mPFC ، قم بلصق الدماغ مباشرة على المسرح (الشكل 1D ، اليسار واليمين). ضع كتلة أجار إضافية خلف الدماغ لتحقيق الاستقرار أثناء التقطيع.
9. ضع المرحلة في غرفة القطع بمحلول القطع المؤكسج المثلج البارد الذي يتم الحفاظ عليه عند 4 درجات مئوية باستخدام وحدة التبريد. تحضير شرائح حادة من اللوزة (320 ميكرومتر) باستخدام شفرة ياقوت. ضع الشرائح في غرفة واجهة مزودة ب ACSF مؤكسج في درجة حرارة الغرفة (RT).
10. بعد تحضير شرائح اللوزة الحادة ، ضع حجرة الواجهة في حمام مائي عند 36 درجة مئوية لاستعادة الشرائح لمدة 35-45 دقيقة. بعد ذلك، قم بإرجاع غرفة الواجهة إلى RT.
11. أثناء بدء الخطوة 1.10، يتم قطع شرائح من مواقع الحقن كما هو موضح من قبل لشرائح اللوزة الحادة (الخطوات 1.8 - 1.9). استعادة الشرائح في الحمام المائي غير مطلوب هنا. اختياري: لتقدير موقع موقع الحقن بسرعة ، راقب الشرائح على مجسم مزود بمصباح فلورسنت ومجموعات مرشحات مناسبة.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1. الحقن التجسيمية ، وتحضير شرائح الدماغ الحادة ، وتصور الألياف قبل المشبكي.(أ ، ب) حقن الفيروس التجسيمي. أ) صورة فأر مخدر موضوعة في إطار تجسيمي مع كشوف الجمجمة وماصة الحقن. الداخل: تكبير صورة ماصة الحقن المملوءة بمحلول الفيروسات الممزوج باللون الأخضر السريع. شريط المقياس: 3 مم. (ب) تخطيطي لجمجمة الفأر مع مواضع محددة لثقوب الحفر لمناطق الحقن المختلفة...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي (ACSF) حلول التصحيح الداخلية كبريتات المغنيسيوم هيبتاهيدرات Roth, ألمانيا P027.1 تحضير محلول مخزون 2M في الماء النقي قطاعة، ميكروم HM650V فيشر ساينتفيك ، ألمانيا 920120 وحدة تبريد لتقطيع الأنسجة، CU65 فيشر ساينتفيك ، ألمانيا 770180 شفرة الياقوت سكاكين ديلاوير الماسية طلب مخصص ، استفسر من الشركة مجسم ، SZX2-RFA16 أوليمبوس ، اليابان مجهر التصحيح ، BX51WI أوليمبوس ، اليابان جهاز التحكم في درجة حرارة الحمام ، TC05 لويجز ونيومان ، ألمانيا 200-100 500 0145 ورق ترشيح نترات السليلوز لغرفة الواجهة Satorius Stedim Biotech ، ألمانيا 13006 - 50 ACN