تقنية لعزل النوى من الخلايا غير العصبية في التلفيف المسنن في الحصين

الملخص

المصدر: Kerloch، T.، et al. الفرز السلبي للنوى المنشطة بالفلورة للخلايا العصبية جنبا إلى جنب مع تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة لدراسة مكانة الحصين العصبية. J. Vis. Exp. (2022).

يوضح الفيديو طريقة لعزل النوى السليمة من الخلايا الدبقية والجذعية في التلفيف المسنن للحصين (DG). يتم فصل أنسجة DG ميكانيكيا في مخزن مؤقت للتجانس البارد لتحرير النوى. يتم التخلص من بقايا الأنسجة والعضيات الأخرى المنبعثة ، ويتم تلطيخ النوى بصبغة الحمض النووي وجسم مضاد مترافق بالفلوروفور خاص بالمستضد النووي العصبي (NeuN). ثم يتم استخدام فرز النوى التي يتم تنشيطها بالتألق لعزل النوى السالبة NeuN للخلايا غير العصبية.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد

1. تشريح DG (التوقيت: 15 دقيقة)

1. تحضير وسائط عزل النوى 1 و 2 (NIM1 و NIM2) ، ومخزن التجانس (HB) ، ووسائط الغسيل (WM) (الجدول 1). ضع جميع المخازن المؤقتة والوسائط والكواشف والأدوات على الثلج لحين الحاجة. ضع الخالط Dounce (انظر جدول المواد) على الجليد أثناء التحضير (1 ساعة على الأقل قبل خطوة التجانس).
   ملاحظه: يمكن تحضير NIM1 وتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر. يجب تحضير NIM2 و HB و WM طازجا.
   أنذر: التلاعب ب dithiothreitol (DTT) ، مثبط الإنزيم البروتيني و Triton X-100 بعناية. هذه المركبات مزعجة للجلد والعين ، وسمة بشكل حاد ، وخطرة على البيئة المائية. أثناء استخدام هذه المواد الكيميائية ، ارتد قفازات واقية وملابس وواقية للعين والوجه ، واغسل يديك جيدا بعد التعامل معها ، وتجنب إطلاقها في البيئة.
2. القتل الرحيم لذكر C57Bl / 6J يبلغ من العمر 22 شهرا عن طريق خلع عنق الرحم باتباع إجراء الجدول الزمني 1 لوزارة الداخل><ية. ملاحظه: انظر المناقشة للحصول على الأساس المنطقي فيما يتعلق باستخدام الفأر البالغ من العمر 22 شهرا في هذه الدراسة. ومع ذلك ، يمكن تنفيذ هذا البروتوكول في أي عمر طوال العمر.
3. قم بتشريح الدماغ من فأر قتل رحيم وانقله إلى طبق بتري مقاس 10 سم مليء بمحلول ملحي 1x مخزن بالفوسفات (PBS) (الشكل 1). ضع طبق بتري على الثلج. قم بإزالة المخيخ باستخدام مشرط وقطع الدماغ إلى نصفين بين نصفي الكرة الأرضية (على طول المحور السهمي).
4. املأ طبق بتري جديد مقاس 10 سم ب PBS المثلج وضعه على الثلج. انقل نصف الدماغ إلى طبق بتري الجديد. باستخدام المناظير ، قم بتشريح DG وكرر هذه الخطوة للحصول على DG الثاني من النصف الثاني من الدماغ.
   ملاحظه: تم تكييف هذه الخطوات (الخطوات 1.2-1.4) من إجراء موصوف سابقا. من المهم المضي قدما في أسرع وقت ممكن في هذه المرحلة للحفاظ على سلامة الخلايا.
5. انقل DGs إلى الخالط Dounce المبرد مسبقا وأضف 1 مل من HB البارد.

فئة

2. تفكك الأنسجة ، وعزل النوى المفردة ، والتلوين المناعي المضاد ل NeuN (التوقيت: 2 ساعة)

1. قم بتجانس الأنسجة ب 10 ضربات من المدقة السائبة "A" ، متبوعة ب 15 ضربة من المدقة الضيقة "B".
   ملاحظه: يجب إجراء تجانس التفريغ باستخدام الملاط على الجليد بضربات لطيفة لتقليل الحرارة الناتجة عن الاحتكاك والرغوة. يجب تبريد جميع المخازن المؤقتة والمعدات مسبقا وحفظها على الجليد أثناء العملية.
2. انقل الجانس إلى أنبوب مبرد مسبقا سعة 15 مل ؛ اشطف الخالط Dounce ب 1 مل من HB البارد واخلطه في نفس الأنبوب. أضف 3 مل من HB إلى أنبوب 15 مل واحتضن لمدة 5 دقائق على الثلج. امزج 2x عن طريق قلب الأنبوب برفق.
3. قم ببللة غطاء مصفاة 70 ميكرومتر مسبقا مع 0.5 مل من HB على أنبوب اختبار سعة 50 مل. قم بتصفية تعليق النوى من الخطوة 2.2 عن طريق قلب الأنبوب سعة 15 مل برفق في مصفاة الخلية. اغسل مصفاة الخلية ب 0.5 مل من HB.
4. قم بإزالة مصفاة الخلية وجهاز الطرد المركزي لأنبوب الاختبار عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، باستخدام جهاز طرد مركزي دلو متأرجح. تخلص من المادة الطافية
   ملاحظه: سيساعد إجهاد المتجانس في تقليل الحطام ، وهو أمر بالغ الأهمية لقياس التدفق الخلوي وتسلسل الحمض النووي الريبي الأحادي النوى (snRNA-seq) خطوات المصب.
5. أعد تعليق الحبيبات برفق في 4 مل من HB باستخدام ماصة P1000. احتضن على الثلج لمدة 5 دقائق. تدور عند 500 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 3 مل من WM.
6. قم بترطيب غطاء مصفاة 35 ميكرومتر مسبقا فوق أنبوب اختبار سعة 15 مل مع 0.5 مل من WM. قم بتصفية تعليق النوى من الخطوة 2.5 عبر مصفاة الخلية، مع سحب 0.5 مل برفق في المرة الواحدة باستخدام ماصة P1000.
7. اغسل غطاء المصفاة ب 0.5 مل من WM وضع الأنبوب على الثلج. انقل المرشح إلى أنبوب جديد سعة 15 مل وجهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق و 4 درجات مئوية عند 500 × جم. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 3 مل من WM.
8. تدور عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من WM باستخدام المستضد النووي المضاد للخلايا العصبية (NeuN) ، والجسم المضاد المترافق AlexaFluor 488 (مضاد NeuN-AF488 ، 1: 32،000) و 1 ميكروغرام / مل 4 ′ ، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). احتضن لمدة 45 دقيقة على الجليد في الظلام.
   ملاحظه: لتحسين التلوين المناعي للنوى المعزولة ، يوصى بمعايرة الجسم المضاد لتحديد التخفيف الأمثل لتحليل التدفق الخلوي والفرز. بعد ذلك ، قم بتشغيل عناصر التحكم المناسبة للتأكد من أن ظروف التلوين هي الأمثل. على سبيل المثال ، مع الجسم المضاد المترافق المضاد ل NeuN-AF488 ، تم تشغيل عنصر تحكم سلبي (أي عدم إضافة الجسم المضاد ، الشكل 2 أ) وتحكم إيجابي (أي تلطيخ بالجسم المضاد ، الشكل 2 ب) لتقييم الفصل بين السكان غير الملوثين والملطخين. عند البدء في العمل مع جسم مضاد مترافق AF488 ، يوصى بتشغيل تحكم في النمط المتقارب AF488 لتقييم الخصوصية. إذا تم استخدام جسم مضاد غير مترافق ، فقد يكون من الضروري التحكم الإضافي مثل إضافة جسم مضاد ثانوي فقط إلى مستحضر النوى لتقييم الارتباط غير المحدد للجسم المضاد الثانوي.

< p class = "jove_title" >3. فرز النوى المنشطة بالفلورة (FANS) لاستبعاد مجموعات الخلايا العصبية (التوقيت: 45 دقيقة)

1. انقل معلق النوى الملطخ بالمناعة إلى أنبوب اختبار سعة 5 مل واحتفظ به على الجليد حتى بدء إجراء قياس التدفق الخلوي.
   ملاحظه: إذا كنت تعمل مع قطع أكبر من الأنسجة من اثنين من DG للفأر ، فقد تكون هناك حاجة إلى مزيد من التخفيف باستخدام المخزن المؤقت WM لتجنب انسداد فارز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) إذا أصبحت كثافة النوى في المحلول عالية.
2. قم بدوامة العينات لمدة 3 ثوان بسرعة منخفضة قبل وضع الأنابيب في أداة FACS (انظر جدول المواد).
   ملاحظة: (إعداد FACS) يجب محاذاة آلات الفرز في بداية الإجراء مع جزيئات المعايرة باتباع توصيات الشركة المصنعة. تمت معايرة تأخير السقوط بالخرز أو الكريات المجهرية (انظر جدول المواد) وفقا لنموذج FACS. تم فرز العينات عند 4 درجات مئوية في وضع النقاء. لتقليل حجم التجميع ، تم فرز النوى من خلال فوهة 70 ميكرومتر عند الضغط الموصى به لمقياس التدفق الخلوي. تم فرز النوى إلى أنابيب منخفضة الارتباط سعة 1.5 مل (انظر جدول المواد) تحتوي على 50 ميكرولتر من WM. تم طلاء جميع أنابيب التجميع ب PBS + 5٪ ألبومين مصل بقري (BSA) عند 4 درجات مئوية طوال الليل لتقليل خطر التصاق النوى بجدران الأنبوب.
3. للحصول على البيانات من عينة من تعليق النوى الملطخة ، اضبط البوابات في ارتفاع DAPI ومنطقة DAPI لاستبعاد حطام الخلية والنوى المجمعة (الشكل 3 أ). علاوة على ذلك ، افصل النوى المفردة عن أي مجاميع أو حطام خلية متبق ملطخ ب DAPI عن طريق ضبط البوابات في منطقة التشتت الجانبي اللوغاريتمي (SSC) ومنطقة التشتت الأمامي (FSC) (الشكل 3 ب).
4. اضبط بوابات مضاد NeuN-AF488 ومنطقة FSC ، لعزل السكان السلبين NeuN-AF488 ، كما هو موضح في الشكل 3C.
5. بعد التحليل ، باستخدام استراتيجية البوابات الموضحة أعلاه ، قم بفرز السكان سالبين NeuN-AF488 في أنبوب تجميع سعة 1.5 مل مملوء ب 50 ميكرولتر من WM.
   ملاحظه: باتباع استراتيجية البوابات الموضحة أعلاه وإجراء التشريح لعزل DG عن دماغ الفأر البالغ ، من المتوقع أن يمثل السكان السلبيون NeuN-AF488 ~ 14٪ من النوى المفردة.

الجدول 1: تركيبات الوسائط والمخازن المؤقتة المستخدمة في الدراسة.

وسط عزل النوى # 1 (NIM1) - يخزن لمدة تصل إلى 6 أشهر عند 4 درجات مئوية مكون الحجم (ميكرولتر) التركيز النهائي (مليمتر) 1.5 م من السكروز 1,833.30 250 حيا 1 م KCl 275 25 1 م ملغن كلوريد₂ 55 5 1 M Tris Buffer ، درجة الحموضة 8.0 110 10 مياه خالية من النوكلياز 8,726.70 - الحجم الإجمالي 11,000 - وسط عزل النوى # 2 (NIM2) - اجعله طازجا مكون الحجم (ميكرولتر) التركيز النهائي نيم 1 10,769 ريال - 1 ملي DTT 11 1 ميكرومتر مثبط البروتياز 100x 110 1x Triton X-100 10٪ (حجم حجمي / حجم) 110 0.1٪ (حجم الحجم/الحجم) الحجم الإجمالي 11,000 - المخزن المؤقت للتجانس (HB) - اجعله طازجا مكون الحجم (ميكرولتر) التركيز النهائي نيم 2 10,958.75 دولار - مثبط RNase ، 40 وحدة ^{ميكرولتر -1} 27.5 100 وحدة ^مل-1 RNasin ، 40 وحدة ^{ميكرولتر -1} 13.75 دولار 50 وحدة ^مل-1 الحجم الإجمالي 11,000 - وسائط الغسيل (WM) مكون الحجم (ميكرولتر) التركيز النهائي BSA 7.5٪ 1,466.70 1٪ مثبط RNase ، 40 وحدة ^{ميكرولتر -1} 27.5 100 وحدة ^مل-1 RNasin ، 40 وحدة ^{ميكرولتر -1} 13.75 دولار 50 وحدة ^مل-1 برنامج تلفزيوني 9,492.05 دولار - الحجم الإجمالي 11,000 -

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: تحضير معلق نوى واحدة من DG التشريح للفئران البالغة لتسلسل snRNA-seq للمجموعات غير العصبية. مخطط التدفق الذي يصف الخطوات الرئيسية للبروتوكول التي تشمل تشريح الماوس DG ، وإعداد تعليق النوى المفردة ، والتلوين المناعي NeuN ، وفرز NeuN-FANS السلبي قبل الشروع في snRNA-seq.

< p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 0.5 مل أنبوب دقيق إيبندورف 30124537 10.00 ميكرومتر فلوريسبرايت YG كربوكسيل مجهرية العلوم المتعددة 15700-10 15 مل أنابيب الطرد المركزي البولي بروبلين كورنينج 430052 2 أزواج من ملقط دومون # 5 المعقم أدوات العلوم الدقيقة 11252-30 4 ′ ، 6-دياميدينو -2-فينيليندول (DAPI) سيجما ألدريتش D9564-10 ملغ 4150 نظام TapeStation رشيق غير متاح 5 مل جولة القاع عالية الوضوح البولي بروبيلين أنبوب اختبار مع غطاء المفاجئة صقر 352063 5 مل أنبوب اختبار البوليسترين القاع المستدير مع غطاء مصفاة الخلية صقر 352235 50 مل أنابيب الطرد المركزي البولي بروبلين كورنينج 430829 مصفاة خلية 70 ميكرومتر صقر هاتف: 352350 8 ذروة SPHERO قوس قزح المعايرة جزيئات BD Biosciences RCP-30-5A حبات Accudrop BD Biosciences غير متاح جهاز الطرد المركزي Allegra X-30R بيكمان كولتر غير متاح الجسم المضاد المضاد ل NeuN ، استنساخ A60 ، Alexa Fluor 488 مترافق ميليبور MAB377X BD FACSAria مقياس التدفق الخلوي الانصهار BD Biosciences غير متاح بيكمان كولتر موفلو XDP بيكمان كولتر غير متاح BSA 7.5٪ جيبكو 15260037 ديثيوثريتول (DTT) الترمو: العلمية R0861 مجموعة مطحنة المناديل Dounce: ملاط ، مدقة سائبة (A) ومدقة ضيقة (B) كيمبل D8938-1مجموعة إيبندورف تيوب بروتين لوبيند 1.5 مل إيبندورف 30108116 Halt ، مثبط البروتياز 100x ثيرموفيشر 78429 كيه سي إل أي مورد كيميائي صنع في المختبر عداد الخلايا الآلي LUNA-FX7 لوغوز بيوأنظمة غير متاح مغنكلوريد₂ أي مورد كيميائي صنع في المختبر N ° 10 مشارط معقمة يمكن التخلص منها سوان مورتون 6601 ريال مياه خالية من النوكلياز سيجما ألدريتش W4502-1L زوج من المقص الجراحي المعقم للطلاب أدوات العلوم الدقيقة 91401-12 برنامج تلفزيوني أي مورد كيميائي صنع في المختبر مثبط RNase 40 U μl-1 أمبيون AM2684 RNasin 40 U μl-1 بروميجا N211A طبق بتري معقم كورنينج 430167 سكروز سيجما ألدريتش 59378-500 جرام عازلة تريس ، درجة الحموضة 8.0 أي مورد كيميائي صنع في المختبر Triton X-100 10٪ (حجم حجمي / حجم) سيجما ألدريتش T8787-250 مل تريبان بلو إنفيتروجين تي 10282