إعادة برمجة مصير الخلية للخلايا الجرثومية للديدان الخيطية إلى خلايا عصبية

الملخص

المصدر: Kolundzic، E.، et al. تطبيق التعبير عن عامل النسخ الناجم عن الصدمة الحرارية RNAi والتعبير عن عامل النسخ الناجم عن الصدمة الحرارية لإعادة برمجة الخلايا الجرثومية إلى الخلايا العصبية في C. ايليجانس. J. Vis. Exp. (2018).

يوضح هذا الفيديو إعادة برمجة مصير الخلية للخلايا الجرثومية الخيطية إلى خلايا عصبية. تتعرض اليرقات المعدلة وراثيا من الديدان الخيطية Caenorhabditis elegans لتداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) لإسقاط عامل منظم للكروماتين معين ، مما يجعل الخلايا الجرثومية من ذريتها أكثر عرضة لإعادة برمجة مصير الخلية. يتم تطبيق الصدمة الحرارية على النسل ، مما يحفز الخلايا الجرثومية على التعبير عن عامل نسخ خاص بالخلايا العصبية يؤدي إلى تحولها إلى خلايا عصبية ، والتي يتم تحديدها باستخدام مراسل الفلورسنت المعبر عنه.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. إعداد الحل

1. ألواح NGM-Agar (1 لتر)
   1. أضف 3 جم من كلوريد الصوديوم و 2.5 جم من وسائط الببتون (على سبيل المثال ، باكتو بيبتون) ، و 20 جم من أجار. بعد التعقيم ، أضف 1 مل من الكوليسترول (5 مجم / مل في مخزون 95٪ من الإيثانول [EtOH]) ، 1 مل من 1 م MgSO₄ ، 1 مل من 1 M CaCl₂ ، 25 مل من 1 M K₂PO₄ ، و 1 مل من الأمفوتريسين B (مخزون 2.5 مجم / مل).
2. ألواح NGM-Agar RNAi (1 لتر)
   1. أضف 3 جم من كلوريد الصوديوم و 2.5 جم من وسط الببتون و 20 جم من أجار. بعد التعقيم ، أضف 1 مل من الكوليسترول (5 مجم / مل في 95٪ مخزون EtOH) ، 1 مل من 1 م MgSO₄ ، 1 مل من 1 M CaCl₂ ، 25 مل من 1 M K₂PO₄ ، 1 مل من الأمفوتريسين B (2.5 مجم / مل مخزون) ، 1 مل من 1 M isopropyl β- d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) ، و 1 مل كاربينيسيلين (50 مجم / مل).
3. لوريا بيرتاني (LB) - أجار (1 لتر)
   1. أضف 10 جم من وسائط الببتون ، و 5 جم من مستخلص الخميرة ، و 5 جم من كلوريد الصوديوم ، و 20 جم من أجار ، و 10 مل من 1 M Tris pH 8.0. أضف H₂O إلى 1 لتر. بعد التعقيم ، أضف 1 مل من 50 مجم / مل كاربينسيلين و 2.5 مل من 5 مجم / مل من التتراسيكلين.
4. رطل متوسط (1 لتر)
   1. أضف 10 جم من وسائط الببتون ، و 5 جم من مستخلص الخميرة ، و 5 جم من كلوريد الصوديوم ، و 10 مل من 1 م من درجة الحموضة 8.0. أضف H₂O إلى 1 لتر. بعد التعقيم ، أضف 1 مل من 50 مجم / مل كاربينيسيلين.
5. المخزن المؤقت M9 (1 لتر)
   1. أضف 6.0 جم من Na₂HPO₄ و 3 جم من K₂PO₄ و 5 جم من كلوريد الصوديوم و 50 مجم من الجيلاتين. قبل الاستخدام ، أضف 1 مل من 1 م MgSO₄.
6. محلول التبييض (10 مل)
   1. أضف 1 مل من كلوريد الصوديوم و 2 مل من 5 نيوتن هيدروكسيد الصوديوم. أضف H₂O إلى 10 مل.

فئة

2. تحضير لوحات RNAi

< p class = "jove_content" >ملاحظة: C. ايليجانس عادة ما يتم استزراعه في المختبر على ألواح بتري 6 سم تحتوي على 7.5 مل من أجار متوسط نمو الديدان الخيطية (NGM-Agar). تم تحسين هذا البروتوكول للديدان التي يتم الاحتفاظ بها عند 15 درجة مئوية. لتحضير الألواح التي تحتوي على NGM ، استخدم تقنيات معقمة قياسية لمنع التلوث الفطري والبكتيري. فيما يلي بروتوكول لإعداد ألواح NGM المكملة بكواشف RNAi.

1. تحضير ألواح NGM-Agar RNAi مقاس 6 سم تحتوي على 1 ملي مولار IPTG و 50 ميكروغرام / مل كاربينيسيلين. دعهم يجفوا لمدة 24-48 ساعة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
   1. احتفظ بألواح RNAi عند 4 درجات مئوية في الظلام. لا تستخدمه إذا كان عمره أكبر من 14 يوما.
2. حدد استنساخ بكتيريا RNAi (الإشريكية القولونية HT115) الذي يحتوي على بلازميد L4440 مع تسلسل الحمض النووي لجين lin-53 من مخزون الجلسرين المجمد من مكتبة RNAi المتاحة13 على ألواح LB-agar التي تحتوي على 50 ميكروغرام / مل كاربينيسيلين و 12.5 ميكروغرام / مل التتراسيكلين باستخدام نمط الخطوط ثلاثي الطور. تنمو البكتيريا عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. يسمح هذا الاستنساخ بإنتاج lin-53 dsRNA المعتمد على IPTG في البكتيريا.
   1. بالإضافة إلى ذلك ، تنمو بكتيريا الحمض النووي الريبي التي تحتوي على بلازميد L4440 دون أي تسلسل جيني كعنصر تحكم في ناقل فارغ.
3. في اليوم التالي ، اختر مستعمرة واحدة من lin-53 أو ألواح LB-agar الفارغة باستخدام طرف ماصة 200 ميكرولتر وتلقيح كل منها في أنبوب استزراع منفصل يحتوي على 2 مل من وسط LB السائل المكمل ب 50 ميكروغرام / مل من الكربينيسيلين. قم بزراعة المزارع بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية حتى تصل إلى كثافة بصرية (OD) عند 600 نانومتر من 0.6 - 0.8. قم بقياس OD باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
   تنبيه: يجب ألا تحتوي وسائط LB السائلة على التتراسيكلين على عكس صفيحة LB-agar المستخدمة لإزالة البكتيريا من مخزون الجلسرين ، لأن إدراج التتراسيكلين أثناء التغذية يؤدي إلى انخفاض كفاءة الحمض النووي الريبي.
4. أضف 500 ميكرولتر من كل مزرعة بكتيرية (lin-53 أو ناقل فارغ) إلى ألواح NGM-Agar RNAi مقاس 6 سم باستخدام ماصة متعددة. احتضن الأطباق بغطاء مغلق طوال الليل في درجة حرارة الغرفة في الظلام حتى تجف. خلال هذا الوقت ، سيؤدي IPTG في ألواح NGM إلى إنتاج dsRNA في البكتيريا.
   1. استخدم ما لا يقل عن 3 أطباق لكل مزرعة بكتيرية لكل تجربة. سيوفر هذا 3 تكرارات تقنية لكل تجربة.
5. قم بتخزين ألواح NGM-agar RNAi المجففة مع البكتيريا عند 4 درجات مئوية في الظلام لمدة تصل إلى أسبوعين.

< p class = "jove_title" >3. تحضير C. ايليجانس سلالة BAT28

1. حافظ على سلالة الدودة BAT288 التي تحتوي على الجينات المعدلة وراثيا otIs305 [hsp-16.2prom:: che-1 ، rol-6 (su1006)] و ntIs1 [gcy-5prom:: gfp] على بكتيريا OP50 باستخدام ألواح NGM-Agar القياسية عند 15 درجة مئوية
   ملاحظة: للاطلاع على بروتوكول مفصل حول استزراع الديدان الخيطية ، انظر. rol-6 (su1006) هو أليل مهيمن وعلامة حقن نمطية شائعة الاستخدام16 تسبب حركة التدحرج النموذجية. يتم استخدامه في الجين المعدل otIs305 لتتبع hsp-16.2prom :: che-1.
   1. احتفظ بسلالة BAT28 عند 15 درجة مئوية في جميع الأوقات لمنع التنشيط الحذر للجين المعدل hsp-16.2prom :: che-1. قلل من التعرض لدرجات حرارة أعلى من 15 درجة مئوية أثناء التعامل مع الإجهاد قدر الإمكان.
2. لمزامنة الديدان مع العمر ، استخدم تقنية التبييض.
   1. اغسل أطباق NGM-Agar مقاس 6 سم التي تحتوي على بالغين وبيض BAT28 باستخدام 900 ميكرولتر من المخزن المؤقت M9. ديدان الحبيبات عن طريق الطرد المركزي عند 900 × جم لمدة 1 دقيقة. قم بإزالة المادة الطافية.
   2. أضف 0.5 - 1 مل من محلول التبييض ورج الأنبوب لمدة 1 دقيقة تقريبا حتى تبدأ الديدان البالغة في الانفجار. المراقبة باستخدام مجهر مجسمة قياسي.
   3. ديدان الحبيبات عن طريق الطرد المركزي عند 900 × جم لمدة 1 دقيقة.
   4. اغسل الحبيبات الدودية 3 مرات بإضافة 800 ميكرولتر من المخزن المؤقت M9 والطرد المركزي عند 900 × جم.
   5. ضع البيض النظيف على أطباق NGM الطازجة المغطاة ببكتيريا OP50. قم بزراعة مجموعة مبيضة على بكتيريا OP50 عند 15 درجة مئوية حتى تصل إلى مرحلة L4 (حوالي 4 أيام). يمكن التعرف على يرقات L4 بواسطة رقعة بيضاء في منتصف الطريق تقريبا على طول الجانب البطني من الدودة18 باستخدام مجهر مجسم قياسي.
      ملاحظه: لتحقيق النمط الظاهري لتحويل الخلية الجرثومية إلى الخلايا العصبية عند استنفاد لين 53 ، يجب استنفاده في الجيل الأبوي (P0). يتم إجراء تسجيل النمط الظاهري للتحويل في الجيل التالي (الجيل الأبوي F1). لتحقيق المستنفد lin-53 بالفعل في P0 ، تتعرض L4 للحمض النووي
   الريبي.
3. انقل يدويا 50 ديدانا من مرحلة L4 لكل تكرار باستخدام سلك بلاتيني إلى لوحة NGM لا تحتوي على أي بكتيريا والسماح للديدان بالابتعاد عن أي بكتيريا OP50 المنقولة. دع الديدان تتحرك على الطبق لمدة 5 دقائق تقريبا. استخدم البكتيريا من صفائح NGM-Agar RNAi التي تم زرعها مسبقا ببكتيريا lin-53 RNAi (أو التحكم في النواقل الفارغة) للنقل إلى ألواح RNAi المعنية.
   1. تجنب نقل بكتيريا OP50 إلى ألواح RNAi الفعلية. اعمل بسرعة لتقليل وقت التعرض للإجهاد لدرجات حرارة أعلى من 15 درجة مئوية.
4. احتضان الديدان على ألواح NGM-Agar RNAi عند 15 درجة مئوية لمدة 7 أيام تقريبا حتى يصل نسل F1 من الديدان إلى مرحلة L3 - L4. يمكن فصلها بوضوح عن P0 لأنها أكبر وأكثر سمكا من ذرية F1.​
   1. تحقق بصريا تحت مجهر مجسمة قياسي ما إذا كانت ديدان ذرية F1 تظهر النمط الظاهري البارز للفرج (pvul) كما هو موضح في الشكل 1. RNAi ضد lin-53 له تأثيرات متعددة الاتجاهات ويسبب النمط الظاهري pvul الذي يمكن استخدامه لتقييم ما إذا كان RNAi ضد lin-53 ناجحا.
      ملاحظه: يمكن أن يتسبب RNAi ضد lin-53 أيضا في وفاة أجنة F1. يزداد هذا التأثير إذا تعرضت الصفائح لدرجات أعلى من 15 درجة مئوية قبل وصول إلى المرحلة L3 - L4. يمكن التعرف على الأجنة الميتة من خلال توقف التطور وقلة الفقس.
   2. احتضان الألواح في الظلام لأن IPTG حساس للضوء.

< p class = "jove_title" >4. تحريض إعادة برمجة الخلايا الجرثومية

1. احتضان فحص ألواح RNAi التي تحتوي على lin-53 وذرية F1 المعالجة بالحمض النووي الريبي الفارغ لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في الظلام لتنشيط CHE-1. استخدم حاضنة ذات فتحات تهوية لأنها تسمح بصدمة حرارية أكثر كفاءة.
2. اسمح للحيوانات المصابة بالصدمة الحرارية بالتعافي لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام ثم احتضان الأطباق عند 25 درجة مئوية طوال الليل في الظلام.
3. باستخدام مجهر مجسم قياسي مقترنا بمصدر ضوء مضان ، افحص تحت مرشح البروتين الفلوري الأخضر (GFP) بحثا عن إشارات مشتقة من gcy-5prom :: gfp في منطقة منتصف الجسم من الديدان كما هو موضح في الشكل 2. ضبط المجهر لإشارات GFP: الحد الأقصى للإثارة عند 488 نانومتر مع الحد الأقصى للانبعاث عند 509 نانومتر.
4. قم بتقييم درجة تحويل الخلايا الجرثومية إلى الخلايا العصبية عن طريق تركيب بإشارات GFP في منطقة منتصف الجسم على شرائح الفحص المجهري المحتوية على وسادة أجار.​
   1. احسب عدد التي تظهر تحويل الخلية الجرثومية إلى الخلايا العصبية مقابل المظلمة لتقييم اختراق النمط الظاهري. عادة ، تظهر حوالي 30٪ من إشارات GFP منفصلة في السلالة الجرثومية عند استنفاد lin-53 ، في حين أن ما لا يزيد عن 5٪ من تظهر إشارات GFP منتشرة في السلالة الجرثومية عند ناقل الحمض النووي الريبي الفارغ.

النتائج

الشكل 1: النمط الظاهري ل pvuالناجم عن الحمض النووي الريبي ضد لين 53. (أعلى) صورة تباين التداخل التفاضلي (DIC) لديدان ذرية L4 / المرحلة الشابة F1 المشتقة من الأمهات المعالجات ب lin-53 RNAi. أشرطة المقياس = 20 ميكرومتر (أسفل) تعرض المعالجة ب lin-53 RNAi النمط الظاهري للفرج البارز (pvul) (رؤوس الأسهم السوداء). يؤكد النمط الظاهري pvul أن الحمض النووي الريبي ضد...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات المواد الكيميائيه أجار أجار ، كوبي الأول روث 5210.1 باكتوبيبتون A. Hartenstein GmbH 211 677 بيبتون ميديا مستخلص الخميرة AppliChem 1552,0100 الأمفوتريسين ب يو بي آيولوجي أ 2220 كلوريد_{الهواء 2} ميرك للعلوم البيولوجية هاتف: 208290 كولسترول روث 8866.2 الجيلاتين روث 4275.3 IPTG سيغما 15502-10 جرام ك_{2ص.ب 4} روث تي 875.2 KH₂PO₄ روث 3904.2 MgSO4 VWR 2,51,63,364 نا₂HPO₄ روث P030.1 كلوريد الصوديوم روث 9265.1 كلوريد الصوديوم روث 9062.3 هيدروكسيد الصوديوم (5 نيوتن) روث ك ك 71.1 تريس روث طر15.2 كاربينسيلين روث 634412 التتراسيكلين روث 2371.2 حاضنات حاضنه نيو برونزويك العلمي C24 م 1247-0052 للصدمة الحرارية حاضنه سانيو مير-5 5534210 للحفاظ على سلالات الدودة عند 15 درجة مئوية أو 25 درجة مئوية المجاهر المجهر الفلوري M205 FA لايكا مجهر (تصوير) + كاميرا تصوير Axio 2 زييس مجهر (تصوير) + كاميرا سينسيكام متلازمة تكيس الأطفال مجهر مجسمة SMZ745 نيكون السلالات البكتيرية الإشريكية القولونية HT115 F- ، mcrA ، mcrB ، IN (rrnD-rrnE) 1 ، rnc14 :: Tn10 (DE3 lysogen: محفز lavUV5 -T7 بوليميراز) (بوليميراز T7 المحفز IPTG) (RNAse III ناقص). الإشريكية القولونية OP50 سلالة Uracil auxotroph E. coli سلالات الدودة BAT28: otIs305 (hsp16.2prom :: che-1 :: 3xHA) ntIs1 (gcy-5prom :: gfp) V. مشتق من OH9846 بمقدار 4 أضعاف العبور الخلفي مع N2 استنساخ RNAi لين -53 المصدرعلم الأحياء رقم التعريف I-4D14 مكتبة Ahringer 16B07 ChromI ، K07A1.12 عارض فارغ: L4440 أدجين #1654 متفرقات. اختيار الدودة عصامي باستخدام ماصة باستور وسلك بلاتيني