$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
إخلاء المسؤولية: تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.
< p class = "jove_title" >
1. التجانس الميكانيكي للدماغ والحبل الشوكي
ملاحظة: المجلدات الموضحة في هذا القسم كافية لتجانس نصف الدماغ أو الحبل الشوكي.
قم - بتبريد الملاط الزجاجي لمطحنة المناديل Dounce (جدول المواد) الموضوعة على الجليد.
- أضف 3 مل من محلول الملح المتوازن 1x Hank المبرد مسبقا (HBSS) إلى الهاون.
- انقل الأنسجة (الدماغ أو الحبل الشوكي) من بئر الصفيحة المكونة من 6 آبار إلى الملاط الزجاجي ، وتأكد من غمسها في 1x HBSS ووضعها في قاع الهاون.
- سحق الأنسجة برفق ب 10 ضربات من المدقة أ متبوعة ب 10 ضربات من المدقة ب. انقل المزيج المتجانس إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل.
- املأ الأنبوب بحجم نهائي يبلغ 10 مل باستخدام 1x HBSS المبرد مسبقا وجهاز الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 320 × جم عند 4 درجات مئوية.
- قم بشفط المادة الطافية وأضف 1x HBSS المثلج إلى كل أنبوب حتى الحجم النهائي 7 مل وأعد تعليق الحبيبات برفق عن طريق الدوامة.
2. إزالة الحطام
ملاحظة: تعد إزالة الحطام ، الذي يتكون بشكل أساسي من أنسجة غير مهضومة وأغماد المايلين ، خطوة حاسمة للسماح بالتلوين الفعال للأنسجة المتجانسة لتحليلات قياس التدفق الخلوي اللاحقة.
- قم بتصفية كل عينة من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر لإزالة أي قطع من الأنسجة غير المهضومة. هذه الخطوة مهمة بشكل خاص عند العمل مع أنسجة الحبل الشوكي ، حيث من المرجح أن تحتوي هذه العينات على شظايا عصبية غير مهضومة أو سحايا يمكن أن تؤثر على الخطوات اللاحقة.
- تأكد من أن الحجم النهائي هو 7 مل في كل أنبوب عينة. إذا لم يكن كذلك ، املأ بالثلج البارد 1x HBSS حتى 7 مل.
- أضف 3 مل من محلول بيركول متساوي التوتر المبرد مسبقا (IPS) إلى كل عينة لعمل حجم نهائي قدره 10 مل من محلول يحتوي على وسط تدرج الكثافة بتركيز نهائي 30٪. قم بتدوير العينات برفق للتأكد من خلطها بشكل متجانس.
- عينات أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة عند 700 × جم عند 18 درجة مئوية ، مع التأكد من ضبط تسارع جهاز الطرد المركزي على 7 والفرامل على 0.
ملاحظه: يجب أن يستغرق الطرد المركزي حوالي 30 دقيقة.
- قم بإزالة العينات بدقة من جهاز الطرد المركزي.
ملاحظه: يجب أن يكون القرص الأبيض المكون من الحطام والمايلين مرئيا عائما على سطح المحلول. يجب أن تكون الحبيبات (التي تحتوي على الخلايا ذات الأهمية) مرئية في الجزء السفلي من الأنبوب.
- استنشق بعناية كل القرص الأبيض من الحطام ثم باقي المادة الطافية ، مع التأكد من عدم إزاحة الحبيبات. اترك حوالي 100 ميكرولتر من المحلول أعلى حبيبات الخلية لتجنب خطر إزاحتها عن غير قصد.
- أضف 1 مل من محلول حجب قياس التدفق الخلوي (FACS) (BL)، وأعد تعليق الحبيبات عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل باستخدام طرف ماصة سعة 1000 ميكرولتر، وانقل العينات إلى أنابيب سعة 1.5 مل.
- جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 450 × جم في درجة حرارة الغرفة (RT).
- استنشاق المادة الطافية برفق وإعادة تعليق الحبيبات في المخزن المؤقت المناسب المتوافق مع التحليلات النهائية