$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
< ص الفئة = "jove_title" >
1. تحضير المواد
- المخزن المؤقت لفرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا (MACS): قم بإعداد 2 ملي مولار من حمض رباعي الأسيتيك ثنائي الإيثيلين (EDTA) و 0.5٪ ألبومين مصل الأبقار (BSA) (جدول المواد) في PBS - / -.
- محلول مخزون الكولاجيناز IV (20 وحدة / ميكرولتر): أعد تعليق المسحوق في PBS +/+ (جدول المواد) ، وقم بتخزينه عند -20 درجة مئوية
ملاحظه: يتطلب الكولاجيناز الرابع أن يكون MgCl2 نشطا بشكل كامل. لا تجميد محلول الكولاجيناز IV بإذابة.
- محلول مخدر ومسكن: امزج 150 ميكرولتر من الكيتامين (150 مجم / كجم) ، و 25 ميكرولتر من الزيلازين (5 مجم / كجم) ، و 330 ميكرولتر من بوبريكير (0.1 مجم / كجم) في 1 مل من PBS- / - .
ملاحظه: قم بإعداد محلول مخدر مسكن بشكل مؤقت ولا تحتفظ به لمدة تزيد عن يوم.
- محلول الهيبارين (100 وحدة / مل): أعد تعليق المسحوق في PBS - /-.
- قم بإعداد نظام التسريب الذي يربط أنبوبا بدورق Erlenmeyer مملوء ب PBS- /-. قم بتوصيل إبرة 23 جم بأطراف أنبوب التسريب. افتح الجزء الداخلي من التسريب واترك PBS يعمل حتى تختفي فقاعات في الأنبوب.
- تحضير العدسة المكبرة مجهرية المجهزة بضوء.
فئة
2. إسكان الفئران C57BL / 6
- لتحليل الخلايا النخاعية أو التائية CP (الضفائر المشيمية) ، استخدم أربعة فئران لكل منها وقم بتجميع الخلايا الدماغية الأربعة (اثنان من كل بطين جانبي ، والبطين الثالث ، والبطين الرابع CP ؛ لثمانية فئران في المجموع). ينطوي عدم تجميع الشلل الدماغي على خطر الفشل في اكتشاف المجموعات المناعية النادرة في الشلل الدماغي بسبب قلة وفرتها.
- دع الفئران تتأقلم لمدة 7 أيام على الأقل قبل أي تجارب. احتفظ بالفئران في ظروف خالية من مسببات الأمراض في درجة حرارة ورطوبة ثابتة ، في دورة ضوء / ظلام مدتها 12/12 ساعة أو 14/10 ساعة ، مع الماء وطعام الحبيبات القياسي الإعلان.
< p class = "jove_title" >
3. نضح PBS وتشريح الدماغ
- وزن كل فأر وحقن 10 ميكرولتر / غرام من محلول مزيج التخدير والمسكن (الخطوة 1.3) داخل الصفاق.
- انتظر حوالي 30 دقيقة للحصول على تسكين فعال (تحقق من عمق التخدير عن طريق الضغط على أصابع الماوس).
- ضع الفأر المخدر بشكل مسطح على ظهره على دعامة التشريح وقم بلصق راحة يده على دعامة التشريح.
- قرص جلد بالملقط واستخدام المقص ، افتح البطن والحجاب الحاجز والصدر لفضح القلب.
ملاحظه: عندما يتم فتح الصدر ، يصبح الدماغ يعاني من نقص الأكسجين. يجب على المرء أن يمضي قدما بدقة وسرعة خلال الخطوات التالية من التروية.
- حقن 20 ميكرولتر من محلول الهيبارين 100 وحدة / مل مباشرة في البطين الأيسر.
- باستخدام مقص ناعم ، قم بعمل شق لا يقل عن 3 مم في الأذين الأيمن للسماح للدم بالتدفق خارج الجسم.
- بعد ذلك مباشرة، أدخل إبرة 23 جم الموضوعة في طرف أنبوب التسريب من خلال طرف البطين الأيسر.
- افتح نظام التسريب بحد أقصى وانتظر التروية الكاملة: باستخدام إبرة 23 جم بمعدل تدفق حوالي 6 مل / دقيقة ، يكتمل التروية في 3 دقائق < / >
ملاحظه: يشهد تغير لون الأعضاء مثل الكبد على فعالية التروية.
- أغلق نظام التسريب وأزل الإبرة من بطين القلب.
- قم بإزالة الشريط من راحة الماوس. ضع الماوس في وضع بطني.
- معسر جلد بالملقط واستخدام المقص ، قم بإزالة الجلد من أعلى الرأس ، من العينين إلى الأذنين.
- بمساعدة المقص ، قم بقص الجمجمة أولا بين العينين ثم بشكل جانبي من كل عين إلى الحبل الشوكي فوق عضلات المضغ مباشرة. لهذا ، استخدم طرف المقص واستمر برفق لتجنب إتلاف الدماغ بالمقص.
- افتح الجمجمة بالملقط عن طريق الضغط عليها من الطرف بين العينين.
- استخدم المقص لقطع الحبل الشوكي واستخراج الدماغ بالملقط ، ووضع نقطتين على الجانب الجانبي من الدماغ لإمالته ووضعه في طبق بتري مليء ب PBS +/+ المثلج. ثم يتم جمع CPs على الفور.
ملاحظه: تحقق من تغير لون الدماغ للتحقق من فعالية التروية.
< p class = "jove_title" >
4. تشريح الضفيرة المشيمية من الدماغ
- ضع الجانب الظهري للدماغ لأعلى في طبق بتري وأسفل أهداف العدسات المجهرية.
- بمساعدة الملقط للحفاظ على الدماغ في مكانه ، أدخل طرفي ملقط آخر لأسفل عبر خط الوسط بين نصفي الكرة الأرضية.
- استخدم الملقط لسحب القشرة مع الثفنة والحصين بعيدا عن الحاجز ، مما يؤدي إلى تعريض البطين الجانبي وجزء من البطين الثالث.
- حدد الشلل الدماغي الجانبي على أنه حجاب طويل يبطن البطين الجانبي الذي يشتعل في كلا الطرفين. استخدم طرفي ملقط رفيع للقبض على CP الجانبي. كن حذرا لجمع الجزء الخلفي المثلث الذي قد يكون مخفيا بواسطة الطية الخلفية للحصين.
- اسحب القشرة والجسم الثفني والحصين في نصف الكرة الأرضية المقابل بعيدا عن الحاجز لكشف البطين الثالث بأكمله والبطين الجانبي المقابل.
- اجمع CP الثالث باستخدام ملقط دقيق ، والذي يمكن تحديده على أنه هيكل قصير مع جانب سطح حبيبي.
- اجمع CP الجانبي الآخر.
- أدخل طرفي الملقط لأسفل بين المخيخ والدماغ المتوسط. افصل المخيخ عن الجسر والنخاع لكشف البطين الرابع.
- حدد CP الرابع على أنه بنية كروية طويلة ذات جانب سطحي حبيبي يبطن البطين الرابع من الطرف الأيمن الجانبي إلى الطرف الأيسر بين المخيخ والنخاع. اجمع CP الرابع باستخدام ملقط ناعم.
ملاحظه: قد يمنع طلاء الملقط ذو القاعدة السيلانية التصاق الملقط على الملقط.
- كرر الخطوات 3.1-4.9 لكل من الفئران السبعة الأخرى. في غضون ذلك ، يمكن الاحتفاظ بالشلل الدماغي المجمعة مؤقتا في أنبوب يوضع على الجليد.
5. تحضير العينات لتحليل قياس التدفق
الخلوي
- املأ الأنبوب الذي يحتوي على جميع CP التشريح إلى 750 ميكرولتر من PBS +/+ .
ملاحظه: ينتج عن ترسب CP المقطوع بملقط رفيع في الأنبوب حجم صغير من PBS +/+. لتجنب الفقدان المحتمل لأنسجة CP ، من الأفضل إكمال الحجم الحالي إلى 750 ميكرولتر بدلا من إزالته واستبداله ب 750 ميكرولتر جديد من PBS +/+.
- أضف 15 ميكرولتر من محلول مخزون الكولاجيناز الرابع 20 وحدة / ميكرولتر (انظر الخطوة 1.2) للحصول على تركيز نهائي قدره 400 وحدة / مل < br / >
ملاحظه: قد يمنع DNAse I (150 ميكروغرام / مل) التكتل المفرط للخلايا.
- احتضان CP مع Collagenase IV عند 37 درجة مئوية تحت تحريض خفيف (300 دورة في الدقيقة) لمدة 45 دقيقة.
- قم بتمرير الماصة برفق لأعلى ولأسفل حوالي 10 مرات لإنهاء تفكك CP.
- املأ أنبوب CP حتى 1.5 مل بمخزن MACS المؤقت (انظر خطوة الوصفة 1.1) لإيقاف نشاط الكولاجيناز IV.
ملاحظه: يتوقف نشاط الكولاجيناز الوريدي عند درجات حرارة منخفضة ويتم تثبيطه بواسطة ألبومين المصل.
- قم بالطرد المركزي للخلايا عند 500 × جم ، لمدة 5 دقائق ، عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية واغسل الخلايا ب 1.5 مل من المخزن المؤقت MACS.
- الطرد المركزي للخلايا عند 500 × جم لمدة 5 دقائق ، عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 220 ميكرولتر من المخزن المؤقت MACS.